《分子診斷第4章》課件

《分子診斷第4章》PPT課件這份課件將介紹分子診斷中的各類技術(shù)和方法。從常用的PCR技術(shù)到最新的DNA芯片技術(shù)，本課程包含了豐富的知識(shí)和實(shí)踐。PCR技術(shù)1PCR原理通過不斷的循環(huán)使目標(biāo)DNA序列在特定引物的引導(dǎo)下擴(kuò)增為一大批相同序列的DNA片段。2PCR反應(yīng)條件溫度循環(huán)，DNA聚合酶，引物，原模板DNA，核苷酸。3PCR反應(yīng)步驟變性，回流，延伸。4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、SYBRGreen染色、TaqMan探針等。電泳技術(shù)凝膠電泳將DNA分子通過電泳變成帶狀的，可通過不同長(zhǎng)度的帶子來判斷不同的DNA分子。PAGE電泳常用于分離和鑒定蛋白質(zhì)，在聚丙烯酰胺凝膠中對(duì)蛋白分子按照分子量大小進(jìn)行分離。雙向電泳組合凝膠電泳和PAGE技術(shù)，可用于分析復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物質(zhì)。Southernblotting技術(shù)Southernblotting原理利用限制性內(nèi)切酶將DNA分子切割成一系列不同大小的片段，然后通過電泳分離不同帶的DNA片段。Southernblotting步驟DNA的電泳分離、轉(zhuǎn)移、固定和檢測(cè)。分子探針制備獲得目標(biāo)DNA的一部分序列，制作RNA探針，通過雜交的方式來檢測(cè)目標(biāo)DNA。分子探針檢測(cè)利用DNADNA的雜交檢測(cè)到定量DNA在我們所選擇的物種樣品中的存在情況。Northernblotting技術(shù)1Northernblotting原理用RNA的分子量大小來將RNA分子分離，再轉(zhuǎn)移到膜上用分子探針檢測(cè)。2Northernblotting步驟RNA的分離、轉(zhuǎn)移、固定和探針檢測(cè)。3RNA探針制備獲得目標(biāo)mRNA的一部分序列，制作DNA探針，通過雜交的方式來檢測(cè)目標(biāo)mRNA。4RNA探針檢測(cè)利用RNA與DNA的雜交檢測(cè)樣品中RNA的存在情況。Westernblotting技術(shù)蛋白質(zhì)分離方法利用SDS電泳技術(shù)將不同分子量大小的蛋白質(zhì)分離開來。抗體制備方法可以通過多種方式制備發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體，比如免疫動(dòng)物制備抗體，單克隆抗體等。Westernblotting步驟蛋白印跡、轉(zhuǎn)移、固定、探針檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)除了標(biāo)準(zhǔn)的西方印跡，也可以應(yīng)用熒光標(biāo)記的抗體來檢測(cè)蛋白質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)1逆轉(zhuǎn)錄PCR原理用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化成DNA，并將DNA擴(kuò)增，以分析RNA表達(dá)的特定功能基因。2逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)步驟RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分析。3特異性引物設(shè)計(jì)選擇合適的引物、檢測(cè)合成合格的基因，并進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，純化擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、鑒定產(chǎn)物可信性。4逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析可以采用凝膠電泳等多種方法。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)1實(shí)時(shí)定量PCR原理測(cè)量實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)過程中耗用的熒光探針，并根據(jù)熒光的強(qiáng)度來計(jì)量PCR反應(yīng)的進(jìn)程。2實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)步驟包括熒光探針制備、反應(yīng)物的加入和熒光檢測(cè)。3熒光探針設(shè)計(jì)熒光探針通常由一個(gè)熒光信號(hào)基團(tuán)、一個(gè)熒光熄滅基團(tuán)和一個(gè)引物分子組成。4實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)分析使用專業(yè)的軟件分析PCR曲線，從而計(jì)算檢測(cè)樣品中的DNA和RNA數(shù)量。DNA芯片技術(shù)DNA芯片原理將數(shù)萬甚至上百萬個(gè)DNA探針固定在芯片上，用于高通量分析DNA、RNA和蛋白質(zhì)等。DNA芯片制備構(gòu)建含有各種基因信息的DNA探針芯片，檢測(cè)芯片的精確度和靈敏度。DNA芯片檢測(cè)用預(yù)先標(biāo)記的RNA或cDNA與芯片上的D