蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在低劑量輻射生物效應(yīng)中的應(yīng)用課件

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及其在低劑量輻射生物效應(yīng)中的應(yīng)用主要內(nèi)容蛋白質(zhì)組學(xué)概述1蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)2在低劑量輻射效應(yīng)中的應(yīng)用3蛋白質(zhì)組學(xué)概述120世紀(jì)三大科學(xué)方案：曼哈頓原子彈研制方案、阿波羅登月方案、人類(lèi)基因組方案(HGP)HGP是由美國(guó)學(xué)者1985年在美國(guó)能源部的一次會(huì)議上討論，并由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者RenatoDulbecco于1986年在Science雜志發(fā)表的一篇文章中提出的.其目的是說(shuō)明人類(lèi)基因組30億個(gè)堿基對(duì)的序列，發(fā)現(xiàn)所有人類(lèi)基因并說(shuō)明其在染色體上的位置，從而在整體上破譯人類(lèi)遺傳信息。該方案啟動(dòng)于1990年，原定15年完成，由于技術(shù)的成熟與基因組測(cè)序的規(guī)?；\(yùn)作，以及來(lái)自商業(yè)競(jìng)爭(zhēng)方面的壓力，2000年6月26日基因組序列草圖測(cè)序完成。人類(lèi)基因組以及多種模式生物、重要生物基因組全序列的完成，標(biāo)志著生命科學(xué)研究進(jìn)入所謂的“后基因組時(shí)代(Postgenomeera)〞,即產(chǎn)生了功能基因組學(xué)〔FunctionalGenomics〕結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：以全基因組測(cè)序?yàn)槟繕?biāo)；“靜態(tài)的〞功能基因組學(xué)：以基因功能鑒定為目標(biāo)，又稱(chēng)后基因組研究；“動(dòng)態(tài)的〞轉(zhuǎn)錄組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)代謝組學(xué)表型組學(xué)相互作用組……功能基因組學(xué)蛋白質(zhì)組(proteome)PROTEOME=PROTEin+genOME最早是由澳大利亞學(xué)者Wilkins和Williams等人于1994年提出，并首次公開(kāi)發(fā)表在1995年7月的Electrophoresis雜志上，指的是由一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)組織或是一種生物的基因組所表達(dá)的全部相應(yīng)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)〔Proteomics〕指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞或組織內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。蛋白質(zhì)組與基因組相對(duì)應(yīng)，也是一個(gè)整體的概念，是基因組表達(dá)的全部蛋白。但兩者又有根本的不同之處基因組是靜態(tài)的，一個(gè)有機(jī)體從它的發(fā)生、開(kāi)展到衰老、死亡，不同細(xì)胞、組織和器官的基因組是根本穩(wěn)定不變。蛋白質(zhì)組作為基因組表達(dá)的產(chǎn)物隨時(shí)間、地點(diǎn)、環(huán)境等條件變化，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的概念。在人類(lèi)基因組方案中大約有30,000個(gè)基因被鑒定出來(lái)。一個(gè)基因=平均4個(gè)左右的剪接變異體，約120,000或更多的獨(dú)立蛋白。翻譯后修飾和蛋白相互作用，蛋白質(zhì)組比基因組復(fù)雜10倍以上。蛋白質(zhì)組學(xué)與基因組學(xué)的聯(lián)系與區(qū)別Proteomics生理病理過(guò)程的復(fù)雜性研究技術(shù)的高通量性人類(lèi)蛋白質(zhì)組正式啟動(dòng)2001年成立國(guó)際人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織〔HUPO〕，啟動(dòng)兩個(gè)首批行動(dòng)方案，2003成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織〔CHHUPO〕人類(lèi)肝臟蛋白質(zhì)組方案〔HLPP〕由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院副院長(zhǎng)賀福初院士領(lǐng)導(dǎo)，16國(guó)80多個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加。中國(guó)第一次領(lǐng)導(dǎo)重大國(guó)際協(xié)作方案。人類(lèi)血漿蛋白質(zhì)組方案〔HPPP〕由美國(guó)科學(xué)家牽頭，13國(guó)47個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究?jī)?nèi)容在蛋白質(zhì)水平上定量、動(dòng)態(tài)、整體地研究生物體，它旨在說(shuō)明生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式及功能模式。1〕組成〔表達(dá)〕蛋白質(zhì)組學(xué)—了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類(lèi)；蛋白質(zhì)表達(dá)譜〔組織、器官、細(xì)胞、亞細(xì)胞分布等〕2〕比較蛋白質(zhì)組學(xué)—尋找正常組織與異常組織蛋白表達(dá)差異3〕結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)—描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位，如與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。4〕功能蛋白質(zhì)組學(xué)—蛋白質(zhì)的功能和相互作用；明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類(lèi)似于電路的網(wǎng)絡(luò)；5〕蛋白質(zhì)組學(xué)研究的技術(shù)平臺(tái)與生物信息學(xué)—?jiǎng)e離、鑒定技術(shù)，分析軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)2蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)蛋白質(zhì)別離技術(shù)基于凝膠系統(tǒng)的別離技術(shù)——雙向凝膠電泳基于非凝膠系統(tǒng)的別離技術(shù)——HPLC；毛細(xì)管電泳蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)Edman測(cè)序質(zhì)譜技術(shù)；生物信息學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)；相互作用研究技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)免疫共沉淀等蛋白質(zhì)別離技術(shù)雙向凝膠電泳根本原理：第一向?yàn)榈入娋劢?Isoelectrofocusing,IEF)，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)不同進(jìn)行別離；第二向?yàn)镾DS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)，按亞基分子量大小進(jìn)行別離優(yōu)點(diǎn)：較高的分辨率，可同時(shí)別離上萬(wàn)種蛋白質(zhì)缺點(diǎn)：不適用于檢測(cè)低豐度蛋白、疏水性及強(qiáng)酸強(qiáng)堿性蛋白；尚不能完全自動(dòng)化，消耗時(shí)間長(zhǎng)。

FirstDimensionIEFSecondDimensionSDSGelStainingSpotExcisionImagingandAnalysis雙向電泳流程SamplePreparation凝膠的圖像處理分析和膠內(nèi)酶切凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測(cè)和定量：凝膠配比：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)呈遞和解釋?zhuān)?-DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立：圖像掃描和分析——ImageScannerII全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)〔EttanSpotPicker〕

蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)Edman降解優(yōu)點(diǎn)：測(cè)定肽序列，非常準(zhǔn)確缺點(diǎn)：本錢(qián)高、測(cè)序速度較慢、靈敏度低，不適合鑒定數(shù)以百計(jì)的蛋白質(zhì)質(zhì)譜法原理：通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值(M/Z值)的蛋白質(zhì)離子別離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集別離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白質(zhì)。具有準(zhǔn)確性、易操作性、快速性及很好的普適性。

應(yīng)用03能為亞微克級(jí)樣品提供信息高靈敏度01適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定與色譜有效聯(lián)用02儀器體積重量大、售價(jià)高、速度慢、維護(hù)復(fù)雜、費(fèi)電缺點(diǎn)04質(zhì)譜分析的特點(diǎn)主要可以分為三種方法肽質(zhì)量指紋圖譜用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽分子量，將所得到的肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索與之相對(duì)應(yīng)的已知蛋白，從而獲取待測(cè)蛋白序列梯狀測(cè)序用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽，名為梯狀測(cè)序，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰峰的質(zhì)量差知道相應(yīng)氨基酸殘基亞穩(wěn)離子利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子，通過(guò)分析相鄰?fù)M類(lèi)型峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基質(zhì)譜分析方法串聯(lián)質(zhì)譜序列分析串聯(lián)質(zhì)譜〔Tandem-MS〕,第一級(jí)質(zhì)譜得到肽的分子離子,選取目標(biāo)肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即N端碎片離子系列〔B系列〕和C端碎片離子系列〔Y系列〕，將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“proteinladdersequencing〞的方法，通過(guò)對(duì)Edman降解法的修改，產(chǎn)生一系列截去N端殘基的肽段，用MALDI-MS測(cè)得這些肽段的質(zhì)量，從而推測(cè)N端序列。生物信息學(xué)技術(shù)通過(guò)質(zhì)譜所獲得的鑒定結(jié)果通常都是高通量且比較復(fù)雜的，分析這些數(shù)據(jù)必須要通過(guò)自動(dòng)化的方式對(duì)其進(jìn)行識(shí)別、比較和分析。生物信息學(xué)〔Bioinformatics〕就是通過(guò)計(jì)算機(jī)以及信息理論對(duì)獲得的蛋白質(zhì)、核酸序列等大量的生物信息進(jìn)行采集、處理、存儲(chǔ)、分析及解釋?zhuān)⒔Y(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)、計(jì)算機(jī)和生物醫(yī)學(xué)等來(lái)獲得其具有的各種生物學(xué)功能的一門(mén)新興的邊緣學(xué)科。借助生物信息學(xué)分析能夠進(jìn)一步了解和分析被測(cè)蛋白的種類(lèi)、屬性、結(jié)構(gòu)、生物功能及其同源蛋白。

蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)SWISS-PROT/TrEMBL；〕基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)Genbank，EMBL，〕蛋白模式數(shù)據(jù)庫(kù)Prosite；〕蛋白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)PDB，；FSSP，〕蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫(kù)OGLYCBASE，OGLYCBASE〕蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白相互作用研究技術(shù)研究蛋白質(zhì)間的相互作用的常用方法：酵母雙雜交系統(tǒng)親和層析免疫沉淀蛋白質(zhì)交聯(lián)酵母雙雜交系統(tǒng)是當(dāng)前開(kāi)展迅速、應(yīng)用廣泛的主要方法。轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNAbindingdomain,簡(jiǎn)稱(chēng)為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,簡(jiǎn)稱(chēng)為AD),它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨(dú)的DB雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與開(kāi)展報(bào)告基因DB與AD別離，不轉(zhuǎn)錄DB與AD結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄--RNA聚合酶雙雜交的原理兩個(gè)等測(cè)蛋白質(zhì)1和2,前者與酵母菌轉(zhuǎn)錄激活因子Gal4的DB