兔epi-lasik、prk術(shù)后視網(wǎng)膜霧狀混淆的形態(tài)學(xué)變化

兔epi-lasik、prk術(shù)后視網(wǎng)膜霧狀混淆的形態(tài)學(xué)變化

從puk和lasek到小型膜分子去除研磨和研磨共磨膠（epi-lasik），表面研磨和研磨是以往的去除膜上皮和保護(hù)膜上皮，發(fā)展到維持完整、高活動的膜上皮，從用滴加化學(xué)法到用膜微鏡法的機械鈍性分離上皮。其中最重要的一點就是角膜上皮下霧狀混濁(Haze)的發(fā)生率減少,本實驗通過建立兔Epi-LASIK和PRK模型,來探討新的表面屈光手術(shù)Epi-LASIK上皮瓣的保留對Haze抑制是否具有優(yōu)越性。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物健康新西蘭白兔18只,月齡4~5個月,體質(zhì)量2.0~3.0kg,雌雄不限,眼科檢查均正常。1.1.2酶學(xué)試劑角膜微型上皮刀(江蘇無錫康明公司KM5000D型),準(zhǔn)分子激光治療儀(美國VISX20/20),裂隙燈顯微鏡(日本拓普康),透射電子顯微鏡(HITACHI-7500日本),轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforminggrowthfactorβ2,TGF-β2)抗體(武漢博士德生物有限公司),SP-9001免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB試劑盒(北京中杉生物技術(shù)開發(fā)公司)。1.2組和實驗方法1.2.1空氣栓塞聯(lián)合頭高通量準(zhǔn)分子激活劑聯(lián)合頭管機聯(lián)合頭關(guān)鍵治療18只實驗兔一眼行Epi-LASIK手術(shù),另一眼行PRK手術(shù),均行相同參數(shù)準(zhǔn)分子激光切削,分別于術(shù)后1周、4周、8周空氣栓塞法隨機處死6只兔(12眼)。1.2.2張皮皮的制備速眠新Ⅱ注射液(長春軍需大學(xué)獸醫(yī)研究所)0.1mL·kg-1肌肉注射全身麻醉,4g·L-1鹽酸奧布卡因眼表面麻醉。Epi-LASIK眼:角膜微型上皮刀制作角膜上皮瓣,行光學(xué)區(qū)6.0mm,屈光度數(shù)-10.00D準(zhǔn)分子激光切削后,上皮瓣復(fù)位;PRK眼:激光加機械法去除角膜上皮后行PRK手術(shù)。術(shù)畢戴角膜接觸鏡(舒晰,強生公司),瞼緣1/3間斷縫合2針。術(shù)后滴諾氟沙星眼液,每天3次,上皮愈合后取角膜接觸鏡。1.3手術(shù)后檢查1.3.1《九》《九分級裂隙燈顯微鏡觀察角膜情況,分別記錄兔眼術(shù)后1周、4周、8周Haze程度及分級。由非本實驗眼科人員采用Fantes分級法結(jié)合Haze面積(以激光切削面積1/2為標(biāo)準(zhǔn),如0.5級Haze面積小于激光切削面積1/2則記為等級1,超過激光切削面積1/2則記為等級2,以此類推)進(jìn)行評估。1.3.2tgf-對照(1)角膜切片標(biāo)本制備:將角膜縱切均分為二,一半常規(guī)石蠟包埋切片備免疫組織化學(xué)染色,另一半用體積分?jǐn)?shù)4%戊二醛固定備透射電鏡檢查。(2)TGF-β2免疫組織化學(xué)染色:石蠟切片脫蠟至水,蒸餾水沖洗3min,體積分?jǐn)?shù)3%H2O2去離子水室溫孵育10min,蒸餾水沖洗,PBS液浸泡5min,加正常山羊血清封閉,37℃孵育15min;加TGF-β2一抗(1:200稀釋),以PBS代替一抗作陰性對照,4℃過夜,PBS沖洗3min×3次,加生物素二抗,37℃孵育15min,PBS沖洗3min×3次,加辣根酶標(biāo)記鏈霉素,37℃孵育15min,PBS洗3min×3次,滴加DAB顯色,蘇木素復(fù)染,干燥,封片。出現(xiàn)棕黃至棕黑色為陽性表達(dá)。ImageProPlus5.0(美國MediaCybernetics公司)圖像分析系統(tǒng)分析,角膜上皮表達(dá)情況以平均光密度(D),角膜基質(zhì)表達(dá)情況以累積光密度(IOD=D×表達(dá)面積)作為統(tǒng)計指標(biāo),每張切片取切削區(qū)為分析區(qū)域,隨機取6個視野進(jìn)行統(tǒng)計,取平均值。1.4tgf-2表達(dá)及數(shù)據(jù)采集本文數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包處理,TGF-β2表達(dá)采用配對均數(shù)t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,角膜Haze程度采用配對比較的秩和檢驗進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩組prk分級比較2組均于術(shù)后1周左右出現(xiàn)Haze,4周時達(dá)最高峰,以后逐漸減退。Epi-LASIK術(shù)后1周、4周、8周Haze等級分別為1.07±0.49、3.38±1.26、2.33±1.50,同時間段PRK術(shù)后Haze等級分別為2.38±1.04、5.00±1.95、3.16±1.32;術(shù)后1周、4周Epi-LASIK組比PRK組輕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z1=-2.57、Z4=-2.41,P均<0.05);8周2組Haze程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z8=-0.96,P>0.05)。2.2組患兒角質(zhì)層結(jié)構(gòu)觀察術(shù)后1周:光鏡下觀察:Epi-LASIK組角膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,上皮與基質(zhì)結(jié)合緊密,膠原排列規(guī)則(圖1A);PRK組角膜上皮層數(shù)增加,細(xì)胞形態(tài)排列基本正常,膠原排列欠規(guī)則(圖1B)。電鏡下觀察:Epi-LASIK組上皮細(xì)胞之間結(jié)合緊密,基底膜完整、連續(xù),與基質(zhì)結(jié)合緊密,切削區(qū)上皮下膠原排列規(guī)則,角膜細(xì)胞呈靜止?fàn)顟B(tài)(圖1C);PRK組上皮細(xì)胞之間相對疏松,可觀察到基底膜欠完整、不連續(xù)和上皮下基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)模糊,膠原排列欠規(guī)則,角膜基質(zhì)細(xì)胞呈增生狀態(tài)、核漿比例擴(kuò)大(圖1D)。術(shù)后4周:光鏡下觀察:2組角膜上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)均基本正常,Epi-LASIK組上皮與基質(zhì)結(jié)合緊密,膠原排列相對比較規(guī)則(圖2A);PRK組上皮下基質(zhì)疏松,可見裂隙形成(圖2B)。電鏡下觀察:2組上皮細(xì)胞之間結(jié)合緊密,Epi-LASIK組基底膜完整、連續(xù)、半橋粒明顯,與基質(zhì)結(jié)合緊密(圖2C);PRK組可見基底膜結(jié)構(gòu)相對完整,仍可觀察到上皮與基質(zhì)間局限性裂隙,切削區(qū)上皮下基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)欠清晰,膠原排列較紊亂,角膜基質(zhì)細(xì)胞增生,核漿比例擴(kuò)大(圖2D)。術(shù)后8周:光鏡下觀察:Epi-LASIK組角膜上皮細(xì)胞排列得更為整齊,形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,上皮與基質(zhì)結(jié)合緊密,膠原排列規(guī)則(圖3A);PRK組角膜上皮層數(shù)增加,細(xì)胞排列較前整齊,上皮與基質(zhì)結(jié)合較緊密,膠原排列較前規(guī)則(圖3B)。電鏡下觀察:2組上皮細(xì)胞之間結(jié)合緊密,基底膜完整、連續(xù),基質(zhì)板層結(jié)構(gòu)清晰(圖3C、3D)。2.3pi-lasik視網(wǎng)膜下tgf-2的表達(dá)-β2表達(dá)角膜上皮TGF-β2表達(dá):術(shù)后1周、4周Epi-LASIK、PRK角膜上皮TGF-β2表達(dá)基本一致,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.81、-1.73,P均>0.05);術(shù)后8周Epi-LASIK角膜上皮TGF-β2表達(dá)明顯比PRK弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.19,P<0.05);提示Epi-LASIK術(shù)后后期角膜上皮TGF-β2的表達(dá)更早趨于穩(wěn)定。角膜基質(zhì)TGF-β2表達(dá):術(shù)后1周、8周Epi-LASIK、PRK角膜基質(zhì)TGF-β2表達(dá)基本一致,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.04、-0.43,P均>0.05);術(shù)后4周Epi-LASIK角膜基質(zhì)TGF-β2表達(dá)比PRK弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.53,P<0.05;圖4)。Epi-LASIK術(shù)后角膜基質(zhì)TGF-β2表達(dá)與Haze均在術(shù)后4周呈現(xiàn)高峰后下降的曲線(圖5)。3光皮質(zhì)激光鏡下haze的發(fā)生率隨著準(zhǔn)分子激光角膜屈光手術(shù)個體化切削的有效開展,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為:表面屈光手術(shù)是個體化切削的最好選擇。然而,Haze的發(fā)生卻讓表面屈光手術(shù)在一定程度上受到限制。最近,一種新的表面屈光手術(shù)方式——Epi-LASIK的初步臨床資料顯示:術(shù)后1a,Epi-LASIK能明顯降低Haze的發(fā)生。而在臨床上,準(zhǔn)分子激光角膜屈光術(shù)后常規(guī)使用糖皮質(zhì)激素眼液滴眼,其具有抑制Haze的作用。那么,臨床上Epi-LASIKHaze的發(fā)生率低,是由于保留了上皮瓣的作用,還是與糖皮質(zhì)激素眼液應(yīng)用聯(lián)合保留上皮瓣的共同作用呢?從解剖結(jié)構(gòu)上說,相對于PRK手術(shù),LASEK和Epi-LASIK保留了上皮瓣,而相對于LASEK,Epi-LASIK保留的上皮瓣形態(tài)結(jié)構(gòu)更為完整。因此,為了更好地探討單純上皮瓣的保留對準(zhǔn)分子激光角膜屈光術(shù)后Haze形成的影響,我們通過建立兔Epi-LASIK和PRK模型,在沒有任何抑制Haze藥物干預(yù)的情況下,采用高屈光度-10.00D切削,來初步了解Epi-LASIK手術(shù)保留上皮瓣的優(yōu)越性。3.1兩組患兒術(shù)后皮細(xì)胞的變化實驗觀察到,Epi-LASIK、PRK術(shù)后均在1周開始出現(xiàn)Haze,在4周時達(dá)到高峰后逐漸下降,PRK出現(xiàn)Haze的變化規(guī)律與以往研究一致;用配對比較的秩和檢驗發(fā)現(xiàn):1周、4周Epi-LASIK術(shù)后Haze比PRK輕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;從光鏡、電鏡觀察到的角膜形態(tài)學(xué)改變來看:1周時Epi-LASIK組術(shù)后上皮細(xì)胞之間結(jié)合比PRK組更為緊密,排列較整齊,基底膜更完整;Epi-LASIK組切削區(qū)上皮下板層結(jié)構(gòu)基本保持較好的排列,角膜細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài);而PRK組切削區(qū)上皮下板層結(jié)構(gòu)模糊區(qū)域較大,角膜細(xì)胞呈增生狀態(tài)。說明Epi-LASIK組角膜組織受到創(chuàng)傷的反應(yīng)較小。4周時上皮結(jié)構(gòu)2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但Epi-LASIK組基底膜和膠原排列更為整齊。目前認(rèn)為Haze組織病理學(xué)基礎(chǔ)是多種膠原、纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸等細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解平衡失調(diào),大量細(xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞間不連續(xù)、不規(guī)則的堆積所引起光線的衍射所致,還包括基質(zhì)層空泡形成、基底膜不連續(xù)和角膜細(xì)胞的增加等異常。因此,從組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)來分析,認(rèn)為Epi-LASIK在術(shù)后1周、4周比同時間段PRKHaze輕。術(shù)后8周時Epi-LASIKHaze比PRK輕,但2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)顯示Epi-LASIK組上皮細(xì)胞更接近于正常組織,但2組基底膜均完整、膠原排列規(guī)則、致密,有力的支持上述Haze的觀察結(jié)果。3.2tgf-參與肌纖維母細(xì)胞表達(dá)的調(diào)控-β2表達(dá)的關(guān)系Haze的形成與角膜創(chuàng)傷愈合反應(yīng)過程有著密切關(guān)系,角膜損傷修復(fù)是一個極其復(fù)雜的過程,在眾多的細(xì)胞因子表達(dá)中,TGF-β尤其是TGF-β2被認(rèn)為是介導(dǎo)角膜細(xì)胞分化為肌纖維母細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控因子。實驗發(fā)現(xiàn):TGF-β2在角膜上皮和角膜基質(zhì)的表達(dá)在術(shù)后1周時開始上升,4周達(dá)高峰后下降,表達(dá)曲線同Haze分級曲線(圖5),表明Epi-LASIK術(shù)后,Haze的形成與TGF-β2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。3.3epi-lasik在haze藥物治療中的作用Epi-LASIK組和PRK組角膜基質(zhì)TGF-β2表達(dá)在術(shù)后1周、8周時無差異,而在4周時Epi-LASIK組表達(dá)明顯減少;結(jié)合Epi-LASIK組在各時間段Haze均比PRK組輕,尤其是在4周時這一現(xiàn)象分析,表明Epi-LASIK組Haze較PRK組輕與TGF-β2在基質(zhì)表達(dá)較少有直接的關(guān)系。那么4周時Epi-LASIK組表達(dá)為何明顯減少?Stramer等發(fā)現(xiàn)兔角膜上皮受到創(chuàng)傷但基底膜完整時,TGF-β2表達(dá)局限在上皮,基質(zhì)無表達(dá)。提示4周時Epi-LASIK組上皮完整性較PRK組恢復(fù)更好,使TGF-β2在基質(zhì)的表達(dá)減少,與透射電鏡對基底膜的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)觀察一致。說明Epi-LASIK上皮瓣的保留對減輕Haze起著重要的作用。本實驗是在沒有抑制Haze藥物干預(yù)的情況下對Epi-LASIK組和PRK組術(shù)后Haze的比較研究,觀察到兔Haze高峰大約在術(shù)后4周時,Epi-LASIK組有明顯的優(yōu)越性,在8周時Epi-LASIK組Haze雖比PRK組輕,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,說明Epi-LASIK上皮瓣的保留對減輕兔高峰期Haze有著重要的作用,對后期的Haze仍需加用藥物干預(yù);而兔角膜自身修復(fù)能力較人強,臨床上觀察到人的Haze高峰在術(shù)后3~4個月,如果不應(yīng)用抑制Haze藥物,大于2級的Haze在高峰期后仍很難消退,將明顯影響術(shù)后的視覺質(zhì)量。因此,提示臨床上術(shù)后應(yīng)用抑制Haze藥物對于減輕Haze是十分必要的。我們觀察到臨