血紅蛋白電泳及其臨床應用

文獻管理序列號：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]文獻管理序列號：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]血紅蛋白電泳及其臨床應用血紅蛋白電泳及其臨床應用鄢盛愷中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學北京協(xié)和醫(yī)院檢查科，北京100730早在60數(shù)年前Pauling等（1949）在研究鐮狀紅細胞貧血患者的血紅蛋白（hemoglobin，Hb）時就發(fā)現(xiàn)其與正常人不同，證明這種異常的Hb在缺氧條件下是產(chǎn)生紅細胞鐮變和溶血性貧血的因素，并提出了“分子病”這一新概念。引發(fā)了人們對Hb構(gòu)造異常及異常Hb與遺傳性貧血之間關系的重視。近年來，由于生化技術和分子生物學技術的不停發(fā)展，相繼發(fā)現(xiàn)和鑒定了許多新型異常的Hb。電泳技術作為分離與鑒定Hb最簡便、精確的辦法之一，廣泛用于臨床遺傳性貧血（如地中海貧血）、異常血紅蛋白病等疾病的臨床診治。1概述Hb的重要生理功效是將氧氣從肺部運輸?shù)浇M織，同時將組織釋放的二氧化碳帶回到肺部完畢氧氣和二氧化碳的交換。Hb是由珠蛋白和亞鐵血紅素連接成的一種結(jié)合蛋白質(zhì)。每一種Hb是由4個多肽鏈構(gòu)成，而每一肽鏈又和一種鐵卟啉結(jié)合。和血紅素連接的珠蛋白是一種組蛋白，每一種珠蛋白分子由4條肽鏈構(gòu)成，每一條肽鏈和一種血紅素結(jié)合，構(gòu)成一種Hb單體或稱為亞單位。因此，每個Hb分子是由4個Hb單體聚合而成的四聚體?，F(xiàn)在已知人類的紅細胞中存在3種正常的Hb，即HbA、HbA2和HbF。從正常Hb中已發(fā)現(xiàn)α、β鏈、γ和δ4種不同肽鏈。這些Hb由均由一對α鏈和一對非α鏈構(gòu)成。正常成人Hb的非α鏈稱為β鏈，而胎兒Hb中的非α鏈稱為γ鏈。HbA含量最多，它由兩條α鏈和兩條β鏈構(gòu)成；HbA2（占3%）由兩條α鏈和兩條δ鏈構(gòu)成。HbF正常含量是Hb的2%，由兩條α鏈和兩條γ鏈構(gòu)成。除HbA、HbA2和HbF外其它的多個Hb常被稱為異常Hb。全世界現(xiàn)在已報道的異常Hb達450余種，并且每年尚有新的發(fā)現(xiàn)。如美國最常見的兩種Hb變異體是HbS和HbC，而HbLepore，HbE，HbA2G-philadelphia等幾類極少見。現(xiàn)已證明這些異常Hb的不同之處不在于亞鐵血紅素部分，而在于珠蛋白部分化學構(gòu)造的差別。重要類型有：⑴肽鏈中氨基酸的次序略有差別。這類型最為多見，約占90%。如HbS（HbA→HbS是由于α2β2→α2β2S），HbC（HbA→HbC是由于α2β2→α2β2C）；⑵各肽鏈的重新組合或某些正常肽鏈的缺失。如HbH（HbA→HbH是由于α2β2→β4），HbBart’s（HbA→HbBart’s是由于α2γ2→γ4）；⑶Hb肽鏈的融合。如HbLepore是δ鏈的二分之一（N端）與β鏈的一端（C端）融合而成；⑷肽鏈中氨基酸增多，可在中間嵌入或在C端延長。等。以前發(fā)現(xiàn)的Hb皆以英文字母命名，由A~Q（B除外，加上S）。隨著新發(fā)現(xiàn)的Hb越來越多，字母不夠用，現(xiàn)規(guī)定從Q后來的字母不能再用以命名，而以發(fā)現(xiàn)地或?qū)嶒炇颐ＥR床實驗室慣用的分離和鑒定Hb的辦法有醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂糖凝膠電泳、柱層析和某些有關的化學實驗。地中海貧血是一種常染色體顯性遺傳病，是我國南方最常見和危害最大的遺傳病之一。應用電泳法鑒別患者血液中Hb的類型及含量對于貧血類型的臨床診療及治療含有重大意義。全自動電泳分析系統(tǒng)的引進將為臨床診療地中海貧血及異常Hb病提供精確的實驗室辦法和根據(jù)。近年來分子生物學技術已用于因異常Hb引發(fā)的遺傳性疾病的基因診療中。I-12Hb電泳2.1原理Hb的分離和鑒定辦法諸多，其中以電泳法最為慣用且最為重要，諸多異常Hb都是首先用電泳法發(fā)現(xiàn)的。其原理是Hb中的珠蛋白和其它蛋白質(zhì)同樣為兩性電解質(zhì)，在不同的緩沖液中可帶正或負電荷，在電場中向陰極或陽極移動。由于不同的蛋白質(zhì)之間（正常Hb與異常Hb）其等電點、分子大小、形狀及所帶電荷的不同，其移動速率不同（電泳遷移率不同），在一定的支持介質(zhì)中可借以分離。不同的電泳辦法含有不同的電場強度、pH、緩沖液或支持物。2.2慣用辦法最慣用的辦法是堿性緩沖液電泳。早期用醋纖膜作為支持介質(zhì)，在堿性環(huán)境下（pH8.4~8.6）可快速分離HbA、HbA2和HbF及其它多個變異體?？墒遣荒軐bS與HbD和HbG分開，由于后3種Hb在這一電泳系統(tǒng)中含有相似的遷移率。同樣，在堿性條件下，HbC、HbE、HbO與HbA2也有相似的遷移率。1976年美國疾病防止與控制中心（CDC）和美國臨床實驗室原則化委員會（NCCLS）曾推薦用醋酸纖維素薄膜電泳（Helena實驗室的辦法與之基本相似）作為異常Hb檢測的初級實驗?，F(xiàn)多用分辨率更高的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。而酸性緩沖液（pH6.0~6.2）電泳可用來分離那些在堿性緩沖液電泳中不能分離開的Hb，如HbS及HbC。在此酸性條件下，HbD、HbO（或HbE）與HbS及HbC可明顯的分開。電泳后Hb可用麗春紅S、酸藍或氨基黑10B進行染色，將電泳區(qū)帶與已知的對照比較，并用光密度計進行掃描定量。對于某些特殊的Hb如HbS、HbA2、HbF和不穩(wěn)定Hb（如HbM、HbH、HbE等）可分別采用溶解度實驗、柱層析法、堿變性法（Singer法）及不穩(wěn)定實驗（異丙醇實驗）進行鑒定。珠蛋白鏈電泳、等電聚焦和氨基酸序列分析可用來證明稀有的Hb存在，多用于研究?，F(xiàn)在已有多個自動化電泳分析儀可應用于臨床常規(guī)Hb電泳，如Helena公司的REP、SPIEF等型號，Sieba公司的HYDRASYS。其中堿性緩沖液電泳為慣用篩選辦法。2.3電泳成果2.3.1堿性緩沖液電泳在堿性緩沖液中全部Hb均向陽極移動，其移動次序為：HbH>HbA3>HbA1>HbF>HbS/HbD/HbG>HbC，HbA2/HbC/HbE/HbO>CA1>CA2（CA1為碳酸酐酶1，CA2碳酸酐酶2）。正常人可見4條區(qū)帶：HbA>HbA2>CA1>CA2（若用聯(lián)苯胺染色，CA1與CA2則不顯色）。在點樣處有一條蛋白帶，它是非Hb成分，為細胞基質(zhì)和膜蛋白。2.3.2酸性緩沖液電泳在酸性緩沖液中，HbA、HbD、HbE和HbG向陰極移動，而HbF比它們更靠近陰極。HbC向陽極移動得最快，HbS也向陽極移動，但比較靠近點樣點。2..3.3成果報告有兩種報告方式：⑴定性：將染色后的電泳膠片用質(zhì)控膠片對比即可判斷膠片有無Hb。⑵定量：染色后的電泳膠片用光密度計掃描，報告各條帶的比例值。各區(qū)帶參考值，根據(jù)不同年紀有不同的范疇。例：正常成人：Hb（A+F）94.5%~98.5%HbA22.5%~3.5%新生兒(1個月)：HbA12%~40%HbF6%~93%HbA20.1%~1.0%嬰兒（3個月）：HbA1.00%—65.00%HbF34.3%—82.95%HbA20.04—2%嬰兒(6個月)：HbA86%~98%HbF0.84%~10.7%HbA20.87%~2.9%I-23臨床意義足月的初生嬰兒血液中的約70%~80%的Hb為HbF，同時也存在少量的HbA和HbA2。很快HbF濃度快速下降，同時HbA對應增加，絕大多數(shù)于出生后6個月至2年后，HbF降至成人的正常水平。HbA2增高是β輕型地中海貧血的一種重要特性。HbA2減低見于缺鐵性貧血及其它Hb合成障礙性疾?。ǔＲ娙绂恋刂泻Ｘ氀?。電泳發(fā)現(xiàn)異常Hb如HbH、HbBart’s、HbC-S、HbK等則可確診為對應的Hb分子病。據(jù)廣東省人民醫(yī)院資料統(tǒng)計，該院一年所做Hb電泳5800人次（全部產(chǎn)前檢查及貧血待查病人），共檢出地中海貧血和異常Hb病患者1375人，陽性率23.7%。其中（1）α地中海貧血基因攜帶者（HbH病患者、PCR確診α-地中海貧血、新生兒HbBart’s區(qū)帶者）1018人，陽性率17.6%。（2）β-地中海貧血基因攜帶者327人，陽性率5.6%。(3)異常HbJ、HbK、HbN、HbG、HbD和HbE共30人占總?cè)藬?shù)0.52%。3.1α-地中海貧血是由于珠蛋白基因缺失或突變，造成α珠蛋白肽鏈合成障礙所致。我國多數(shù)是α珠蛋白基因缺失。3.1.1靜止型α-地中海貧血無臨床癥狀、體征、無貧血，紅細胞形態(tài)正常。HbA2和HbF正常，新生兒期可出現(xiàn)1%~3%HbBart’s，出生后3個月消失。父母任一方有α-地中海貧血。3.1.2原則型輕型患者無癥狀。呈輕型小細胞低色素性貧血。有輕度紅細胞形態(tài)變化。HbA2含量為正常低限（1.5%~2.5%），β/α約1.4/1，HbF正常。新生兒期HbBart可達5%~8%，6個月完全消失。父母任一方有α-地中海貧血。3.1.3HbH病臨床體現(xiàn)有輕、中度貧血，2/3以上病例有肝脾腫大，常重復出現(xiàn)黃疸。在妊娠、感染及使用氧化劑時，Hb顯著下降。父母雙方常有α-地中海貧血。實驗室檢查：有溶血性貧血的特性，骨髓中紅細胞系統(tǒng)增生極度活躍。HbH明顯增高（2.5％~40％），HbA2及HbF含量正常。Hb電泳可出現(xiàn)HbH區(qū)帶。紅細胞滲入脆性實驗減少，紅細胞包涵體陽性。3.1.4HbBart’s胎兒水腫綜合征臨床體現(xiàn)：該病為α-地中海貧血中最嚴重者，胎兒常于妊娠后期死亡或早產(chǎn)。胎兒生下時，全身水腫，皮膚蒼白，黃疸，肝脾腫大，常于產(chǎn)后數(shù)小時內(nèi)死亡。父母雙方都有HbH病或原則型α-地中海貧血。實驗室檢查：有溶血性貧血的特性，骨髓紅系增生活躍。紅細胞形態(tài)靶形紅細胞明顯增多，外周血可見有核紅細胞。Hb電泳：HbBart成分>80％，抗堿Hb增加，出現(xiàn)少量HbPortland或少量HbH。3.2β-地中海貧血是由于β珠蛋白鏈合成減少或完全不能合成所致。完全不能合成β珠蛋白鏈的地貧基因稱為β0，合成減少的稱為β+。3.2.1重型臨床體現(xiàn)：又稱庫利氏貧血（Cooleyanlsnua）患者癥狀嚴重，多在小朋友期夭折。少數(shù)癥狀較輕，可活至成年，此型又常稱為中間型。庫利氏貧血在嬰兒期6~9個月開始出現(xiàn)貧血，黃疸、肝脾腫大。小朋友患者發(fā)育不良、智力遲鈍、骨骼變化如顴骨隆起，眼距增寬，鼻梁低平。Ｘ線可見外板骨小梁條紋清晰呈直立的毛發(fā)樣等。多在幼兒時死于重度貧血或感染。若能生長超出10歲，可出現(xiàn)個體矮小，性功效、甲狀腺及甲狀旁腺等功效低下，可繼發(fā)血色病，出現(xiàn)心律系亂、心力衰竭、肝硬化、糖尿病等。父母常都有輕型?-地中海貧血。實驗室檢查：Hb<60g/L，呈小細胞低色素性貧血，靶形細胞多見，網(wǎng)織紅細胞增多；骨髓紅系統(tǒng)輕度增生。Hb電泳：HbF>30％。I-33.2.2輕型臨床體現(xiàn)：無癥狀或有輕度分血癥狀，肝脾無腫大或輕度腫大。父母一方為β-地中海貧血雜合子。實驗室檢查：Hb稍減少或正常，外周血少量靶形細細胞。HbA1>3.5％，HbF輕度增加（不超出5％）。I-33.2.3中間型臨床體現(xiàn)：癥狀和體征介于重型和輕型?-地中海貧血之間。實驗室檢查：同重型?-地中海貧血。遺傳學：父或母均為?-地中海貧血雜合子狀態(tài)。根據(jù)臨床體現(xiàn)，小細胞低色素性貧血，Hb電泳及HbF、HbA2含量測定有家族史，普通不難作出診療。3.3異常Hb病異常Hb病指因正常成人HbA的產(chǎn)生受到部分或完全的克制，被另一種或幾個異常的Hb部分或完全取代而產(chǎn)生的病癥，例如HbS和HbC等常與溶血性貧血、鐮狀紅細胞或靶形紅細胞等特性聯(lián)系在一起。事實上，某些異常Hb的存在，并不引發(fā)生理上的任何特性，也并不是全部異常Hb攜帶者都有特殊的臨床體現(xiàn)。有些異常Hb攜帶者，能夠終身健康地生活，僅在居民普查或因其它疾病就醫(yī)時才被發(fā)現(xiàn)。固然，這些Hb變異體仍有其生物化學、遺傳學及人類學意義。那些有臨床意義的異常Hb，涉及到防止，治療等一系列問題。早期發(fā)現(xiàn)的某些Hb變異體，如HbＳ、Ｃ、Ｄ、Ｅ等，多出現(xiàn)在溶血性貧血患者身上?，F(xiàn)在看來，有某