中藥復(fù)方對(duì)慢性約束性應(yīng)激大鼠海馬中總rna的影響

中藥復(fù)方對(duì)慢性約束性應(yīng)激大鼠海馬中總rna的影響

根據(jù)研究數(shù)據(jù)，內(nèi)源性氨基酸廣泛參與靶場(chǎng)的調(diào)節(jié)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫球蛋白之間發(fā)揮重要作用。在前一種實(shí)驗(yàn)中，作者發(fā)現(xiàn)在適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)過(guò)程中，身體的免疫功能顯著降低。本實(shí)驗(yàn)對(duì)其發(fā)生的機(jī)理進(jìn)行深入研究,旨在揭示慢性束縛應(yīng)激產(chǎn)生的機(jī)理,以及中藥復(fù)方抗慢性束縛性應(yīng)激的機(jī)理。材料和方法1.動(dòng)物和綜合體、實(shí)驗(yàn)中的中藥、模型方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理參見(jiàn)已發(fā)表論文。2.試劑和機(jī)器2.1生物酶活性的研究TRIZOLReagent(Gibcol公司)、DEPC(Sigma),DNA分子量Marker(DL2000,Takara),λ/DNAHindⅢMarker(華美生物工程公司),TaqDNAPolymerase、dNTP(Promega),RT-PCR試劑盒(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司),氯仿、異丙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)。2.2主要的檢測(cè)儀器2Κ15高速低溫冷凍離心機(jī)、SEM-320型電泳儀、PCR儀、DF-C恒壓恒流電泳儀、臺(tái)式培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、8823A型紫外檢測(cè)儀、組織研磨器、FIT-5000凝膠圖像分析系統(tǒng)。3.實(shí)驗(yàn)方法3.1rna的提取RNA的提取和含量的測(cè)定造模結(jié)束后,立即將大鼠斷頭處死。在冰盤上取雙側(cè)海馬。100mg海馬組織中加入1ml預(yù)冷的TR-IZOL,在組織研磨器中充分研磨,冰上放置5min。按說(shuō)明書方法提取RNA。取約2μl總RNA樣品,在1%瓊脂糖,TAE緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行電泳。電泳條件為:恒壓100V,電泳約20min。凝膠成像系統(tǒng)下觀察28S、18S、5S條帶的情況。取出適量RNA樣品稀釋成一定倍數(shù)(10或20倍),應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。根據(jù)A260的值計(jì)算RNA濃度,并根據(jù)A260/A280比值計(jì)算其純度,要求為1.8～2.0,比值低于1.7者棄去。3.2半定量pcr檢測(cè)根據(jù)Genebank的序列,用Primer5.0軟件分別設(shè)計(jì)了β-actin、腦啡肽(enkephalin,Enk)和前強(qiáng)啡肽(prodynorphin,Prod)的引物,由三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成。其中β-actin作為半定量PCR的內(nèi)參照。引物序列如下:(1)β-actin:上游引物:5ue78d-CATCTCTT-GCTCGAAGTCCA-3ue78d,下游引物:5ue78d-ATCATGTTT-GAGACCTTCAACA-3ue78d;(2)Enk:上游引物:5ue78d-ATG-GCGTTCCTGAGACT-TTGA-3ue78d,下游引物:5ue78d-TAGAGTTTTGGCGTATTT-CGGAGGC-3ue78d;(3)Prod:上游引物:5ue78d-ATGGCGTGGTCCAGGCTGATGC-3ue78d,下游引物:5ue78d-AGTTTGTAGATTTAGAAGCCTTATCC-3ue78d。分別擴(kuò)增Enk基因(810bp)、Prod基因(747bp)。3.3反向轉(zhuǎn)移反應(yīng)3.4礦物油pcr反應(yīng)PCR反應(yīng):取等量的RT-PCR產(chǎn)物,分別擴(kuò)增β-actin、Enk和Prod基因。(1)50μl反應(yīng)體系包括:RT反應(yīng)產(chǎn)物6μl,10×PCRBuffer4.5μl,dNTP(10mmol/L)1μl,SensePrimer(Enk或Prod)1μl(50pmol),AntisensePrimer(Enk或Prod)1μl(50pmol),TaqDNA聚合酶1μl,DEPC-ddH2O35.5μl。同時(shí),將Enk或Prod的引物換為β-actin的引物,其它反應(yīng)體系與上述相同進(jìn)行PCR反應(yīng)。(2)混勻后離心,加入50μl輕質(zhì)礦物油進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3min;94℃40s;52℃45s,72℃45s,進(jìn)行30個(gè)循環(huán);之后72℃再延伸15min。(3)PCR反應(yīng)結(jié)束后,取10μl的PCR產(chǎn)物,同時(shí)選用DL2000核酸分子量Marker在1%瓊脂糖凝膠上電泳,恒壓100V,電泳約20min,以使產(chǎn)物充分分離,觀察目的DNA的大小。3.5瓊脂糖凝膠的圖像分析PCR反應(yīng)產(chǎn)物20μl進(jìn)行核酸電泳,對(duì)經(jīng)過(guò)電泳之后的1%瓊脂糖凝膠用FIT-5000凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描分析,以在組織中表達(dá)穩(wěn)定的β-actin條帶作為內(nèi)參照,用目的基因的光密度與內(nèi)參照條帶的光密度的比值為半定量分析數(shù)據(jù)。結(jié)果1.總氮電泳的結(jié)果2.各組enkmrna表達(dá)水平的比較由表1可見(jiàn),7天模型組大鼠海馬的ProdmR-NA的表達(dá)水平明顯升高,與正常對(duì)照組比較P<0.01,EnkmRNA含量雖也有上升,但是與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。21天模型組的EnkmR-NA、ProdmRNA的表達(dá)水平都比正常對(duì)照組和7天模型組有明顯的升高(P<0.01)。逍遙散組和四君子湯組的EnkmRNA的表達(dá)水平較21天模型組有顯著降低(P均<0.01),金匱腎氣丸組的EnkmRNA表達(dá)水平雖然較21天模型組有所降低,但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三個(gè)用藥組都能不同程度地降低海馬中ProdmRNA的表達(dá),與21天模型組相比P均<0.01。逍遙散組的EnkmRNA和ProdmRNA的表達(dá)水平明顯比金匱腎氣丸組低(P<0.05,P<0.01)。腦啡肽對(duì)海馬免疫功能的抑制作用內(nèi)源性阿片肽是在哺乳動(dòng)物腦中天然生成的具有阿片樣作用的物質(zhì)的一種,主要分為腦啡肽家族、內(nèi)啡肽家族和強(qiáng)啡肽家族。有研究資料表明內(nèi)源性阿片肽廣泛參與應(yīng)激的調(diào)節(jié),并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間起著重要的調(diào)節(jié)作用。作為內(nèi)源性阿片肽的一種,腦啡肽在腦內(nèi)分布廣泛,它生成和釋放后,通過(guò)內(nèi)阿片肽受體發(fā)揮一系列作用,除了鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)心血管、呼吸和體溫外,還有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,對(duì)正常狀態(tài)下和應(yīng)激狀態(tài)下的機(jī)體免疫功能都有一定的影響。研究表明腦啡肽中的甲硫腦啡肽和亮腦啡肽都可影響正常人T淋巴細(xì)胞活性、花環(huán)形成率及自然殺傷細(xì)胞的活性。甲硫腦啡肽和亮腦啡肽可以明顯抑制電擊應(yīng)激大鼠自然殺傷細(xì)胞毒的作用并能被納洛酮阻斷,說(shuō)明機(jī)體內(nèi)源性阿片肽樣物質(zhì)在應(yīng)激刺激免疫功能中有重要作用。海馬是內(nèi)啡肽調(diào)節(jié)免疫的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),而白細(xì)胞介素1α(IL-1α)則是它調(diào)節(jié)免疫的重要介質(zhì)。研究表明,大鼠海馬內(nèi)微量注射甲硫腦啡肽或亮腦啡肽能明顯增強(qiáng)刀豆蛋白A刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(小鼠的實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)),并且用RT-PCR技術(shù)證明了腦啡肽抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的大鼠海馬腦區(qū)IL-1α基因表達(dá),在離體培養(yǎng)的新生大鼠海馬膠質(zhì)細(xì)胞上,進(jìn)一步證實(shí)這種作用,由于這種抑制作用可被阿片受體阻斷劑納洛酮所阻斷,所以這種抑制性影響可能是通過(guò)作用于海馬膠質(zhì)細(xì)胞上的阿片受體所致。據(jù)報(bào)道,丘腦、下丘腦、海馬、嗅球、弓狀核、室旁核等神經(jīng)元均有IL-1免疫活性物質(zhì)及受體,以IL-1作下丘腦推挽灌流可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子的釋放,通過(guò)垂體-腎上腺軸,進(jìn)而抑制外周免疫功能。這些結(jié)果說(shuō)明中樞內(nèi)IL-1很可能參與機(jī)體免疫功能的負(fù)性調(diào)節(jié)。腦啡肽對(duì)海馬膠質(zhì)細(xì)胞IL-1基因表達(dá)的抑制性作用,解釋了海馬內(nèi)注射腦啡肽增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)的機(jī)理,即腦啡肽通過(guò)作用于具有產(chǎn)生IL-1α能力的海馬膠質(zhì)細(xì)胞或某些神經(jīng)細(xì)胞膜上的阿片受體,抑制IL-1α基因表達(dá),從而減少腦內(nèi)IL-1α合成,導(dǎo)致IL-1α對(duì)下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸的激活效應(yīng)減弱,并通過(guò)降低血液中腎上腺皮質(zhì)激素的含量增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。但有些學(xué)者對(duì)腦啡肽的免疫調(diào)節(jié)作用有著不同的認(rèn)識(shí),他們認(rèn)為腦啡肽對(duì)免疫功能的作用與劑量有關(guān),即在小劑量可增強(qiáng)免疫功能,大劑量則產(chǎn)生抑制效應(yīng)。但是腦啡肽對(duì)免疫系統(tǒng)的影響還可以通過(guò)交感神經(jīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。有研究表明第三腦室內(nèi)注射Met-Enk后引起脾淋巴細(xì)胞增殖的降低,但是這種效應(yīng)并不是Met-Enk的外周效應(yīng)。因?yàn)镸et-Enk作為中樞神經(jīng)遞質(zhì),其血腦屏障的通透率很低,并且在血液中有大量的高降解能力的氨基肽酶,可以在很短的時(shí)間內(nèi)將血液中的Met-Enk降解。所以可以認(rèn)為這種效應(yīng)是Met-Enk與第三腦室周圍組織作用的結(jié)果。它雖不與外周免疫細(xì)胞直接接觸,但可以通過(guò)作用于中樞的某些核團(tuán),改變核團(tuán)神經(jīng)元的興奮性,再通過(guò)神經(jīng)回路或神經(jīng)內(nèi)分泌回路影響外周免疫反應(yīng)。Met-Enk的信號(hào)傳遞到免疫系統(tǒng)主要依賴于HPA軸或淋巴器官上分布的交感神經(jīng)系統(tǒng)。已證明脾交感神經(jīng)纖維末梢有可能與脾實(shí)質(zhì)淋巴細(xì)胞之間進(jìn)行突觸樣化學(xué)傳遞。所以MetEnk可以通過(guò)影響交感神經(jīng)來(lái)影響機(jī)體的免疫功能。此外IL-2或干擾素(IFN-α)也可能在中樞內(nèi)通過(guò)阿片受體途徑影響脾交感神經(jīng)興奮性而最終調(diào)節(jié)脾淋巴細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)表明在慢性束縛應(yīng)激7天時(shí),EnkmR-NA在海馬中的表達(dá)就有所上升,但是不甚明顯,束縛21天時(shí)上升較為明顯,與正常對(duì)照組和7天模型組比較P<0.01。Enk含量的上升會(huì)抑制中樞IL-1α基因表達(dá),可能會(huì)引起腦內(nèi)的IL-1α水平有所下降。逍遙散和四君子湯能夠明顯抑制海馬EnkmRNA的上升,可能是它們?cè)鰪?qiáng)機(jī)體免疫功能的重要機(jī)理之一。金匱腎氣丸抑制EnkmRNA上升的效果不顯著,但是它增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用十分顯著,這提示機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)是通過(guò)多種途徑進(jìn)行的,Enk對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)只是影響免疫功能的途徑之一。前強(qiáng)啡肽是內(nèi)源性阿片肽家族的另一重要成員。在紋狀體、海馬和下丘腦中含量最高。前強(qiáng)啡肽mRNA的生成在許多腦區(qū)內(nèi)均受某些狀況影響,例如在新紋狀體中,γ-氨基丁酸(GABA)可使其降低。海馬中的前強(qiáng)啡肽mRNA則受點(diǎn)燃作用的下向調(diào)節(jié)。強(qiáng)啡肽具有極強(qiáng)的阿片活性,近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)急性腦出血患者血漿中有強(qiáng)啡肽A的增高,提示它可能是繼發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的重要因素之一。但是也有不同學(xué)者認(rèn)為強(qiáng)啡肽A對(duì)腦缺血有保護(hù)作用,有研究表明側(cè)腦室內(nèi)注射強(qiáng)啡肽A,可使腦缺血大鼠大腦皮層水腫明顯減低,同時(shí)皮層內(nèi)Ca2+含量明顯減低,而Mg2+含量增高。強(qiáng)啡肽A1-13還與機(jī)體的免疫功能調(diào)節(jié)有密切的關(guān)系,研究表明在大鼠燒傷應(yīng)激后脾內(nèi)強(qiáng)啡肽A1-13的含量明顯下降。這說(shuō)明強(qiáng)啡肽A1-13可能是通過(guò)脾臟上的阿片受體,引起機(jī)體免疫功能抑制的,從而也提示它能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。分子生物學(xué)水平證實(shí)在慢性嗎啡依賴大鼠海馬、紋狀體、下丘腦中前強(qiáng)啡肽原mRNA水平明顯下降,這種變化可能是阿片類藥物依賴和耐受的重要神經(jīng)生物學(xué)機(jī)理之一。由上可見(jiàn),強(qiáng)啡肽A發(fā)揮不同作用時(shí)所通過(guò)的途徑也不同。強(qiáng)啡肽A另一個(gè)重要作用特點(diǎn)是它只在機(jī)體病理或損傷過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用,對(duì)在正常狀態(tài)下的大鼠影響不大。本實(shí)驗(yàn)表明,在慢性應(yīng)激狀態(tài)下海馬內(nèi)的前強(qiáng)啡肽mRNA表達(dá)有明顯的上升,而且它的變化可能要比腦啡肽的變化早。從以前試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,在慢性束縛性應(yīng)激狀態(tài)下,強(qiáng)啡肽上升會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成一定的損傷,因?yàn)槟X源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白(NT3)的含量在應(yīng)激時(shí)都有所下降,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用降低。上述三個(gè)復(fù)方都對(duì)應(yīng)激大鼠有一定