電針創(chuàng)作對骨癌痛大鼠行為學(xué)及下丘腦-內(nèi)啡肽含量的影響

電針創(chuàng)作對骨癌痛大鼠行為學(xué)及下丘腦-內(nèi)啡肽含量的影響

《素文天元學(xué)說》一文寫道：“一切刺傷之都必須首先治理上帝?！薄！薄鹅`樞·刺節(jié)真邪》亦談:“用針之類,在于調(diào)氣?！惫蕦?shí)驗(yàn)用動(dòng)物采用電針“調(diào)氣”,即調(diào)節(jié)機(jī)體的氣血運(yùn)行。本實(shí)驗(yàn)觀察電針攢竹穴對骨癌痛大鼠所引起的下丘腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)中β-內(nèi)啡肽(β-Endorphin,β-EP)含量的改變,說明電針對骨癌痛的影響和調(diào)節(jié)作用。1材料和方法1.1行為測定時(shí)間重70~80g雌性Wistar大鼠1只,SD雌性大鼠40只,體重180~200g,由山東省青島市派特福德白鼠養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供。購入后適應(yīng)飼養(yǎng)1周,清潔飲水,自由攝食,每次行為實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)性訓(xùn)練,以排除應(yīng)激干擾。行為學(xué)測定時(shí)間在上午10點(diǎn)至下午2點(diǎn)之間。按隨機(jī)數(shù)字表將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、電針組,每組10只。1.2試劑、儀器和儀器Walker256乳腺癌細(xì)胞株由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供,10%水合氯醛(武漢博士德生物工程有限公司),Rabbitanti-β-EP試劑、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),JL-C2刺激器(與上海嘉龍教儀廠合作改裝),0.22mm×13mm針灸針(蘇州東邦醫(yī)療器械有限公司),YLS-3E電子壓痛儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站),YLS-6B智能熱板儀(濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司),韓氏電針儀LD202H(北京華衛(wèi)公司),Bx-600光學(xué)顯微鏡(上海儀圓光學(xué)儀器有限公司),眼科手術(shù)器械、針、線、血管鉗、鑷子等。1.3大鼠腹水瘤細(xì)胞的制備將1只重70~80g雌性Wistar大鼠腹部注射入制備好的0.5ml乳腺癌walker256細(xì)胞懸液(約2×107cells/ml),約6~7天后,大鼠腹部明顯膨隆時(shí),抽取大鼠腹水制成2×104cells/ml的大鼠腹水瘤細(xì)胞懸液,置于冰上保存。對模型組和電針組SD大鼠左側(cè)脛骨結(jié)節(jié)下外方與骨面呈45°朝尾側(cè)進(jìn)針,注入細(xì)胞懸液5ul(1×105cells),用無菌骨蠟封閉針孔。假手術(shù)組注入等量無菌生理鹽水。空白組不做處理。1.4額骨近內(nèi)瞳電刺激器制備電針組在手術(shù)后8天開始治療,取“攢竹”穴,參照人體穴位骨性標(biāo)志對大鼠穴位定位,在大鼠的額骨近內(nèi)眥前1/3處,內(nèi)眶緣斜面向內(nèi)眥方向平刺5mm,以0.22mm×13mm的毫針進(jìn)行針刺,雙側(cè)接電刺激器,頻率:2/100Hz,強(qiáng)度:0.3mA。每次留針13min,每日1次,連續(xù)治療6天,停1天,再連續(xù)治療6天。1.5行為測試每日觀察大鼠的皮毛、精神狀態(tài)、步態(tài)以及對食物和水的攝入量、體重等是否有改變及改變的程度變化。1.5.1機(jī)械疼痛敏感pdt各組于造模前用YLS-3E電子壓痛儀測定鼠尾基礎(chǔ)機(jī)械痛閾,并于造模5天開始隔天1次測量各組大鼠鼠尾機(jī)械性痛閾。1.5.2熱敏敏度pwl各組于造模前使用YLS-6B智能熱板儀測定基礎(chǔ)熱痛閾,造模5天開始隔天1次評價(jià)大鼠對熱刺激的反應(yīng)。1.6免疫組化試驗(yàn)1.6.1材料的選擇和染色造模21天行為學(xué)測定完畢后,將大鼠斷頭,冰浴條件下迅速取腦組織后行固定、石蠟包埋、切片;HE染色、常規(guī)進(jìn)行β-EP免疫組化法測定。1.6.2光密度和顆粒面積測量BX-600光學(xué)顯微鏡下觀察,每組選10張切片,每張切片選取3個(gè)視野,測量大鼠下丘腦β-EP樣陽性纖維的光密度和顆粒面積。應(yīng)用Image-ProPlus6.0光學(xué)分析軟件進(jìn)行分析,對不同組別下丘腦核團(tuán)β-EP陽性纖維進(jìn)行定量分析。1.7差異的顯著性分析實(shí)時(shí)定量數(shù)據(jù)用SPSS18軟件進(jìn)行分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異采用方差分析(ANO-VA),以P<0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果大鼠于造模8天左右逐漸出現(xiàn)皮毛不亮、喜臥、不喜動(dòng),偶爾出現(xiàn)間歇性跛行,食物攝入量較空白組大鼠減少,體重增加幅度減小。2.1各組患兒手術(shù)前后血壓變異造模9天起,模型組機(jī)械性痛敏與空白組、假手術(shù)組和電針組相比有顯著性差異(P<0.05);電針組與空白組、假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.05)。各組大鼠機(jī)械性痛敏見圖1。2.2各組患兒手術(shù)前后血壓變異造模11天起,模型組熱痛敏與空白組、假手術(shù)組和電針組相比有顯著性差異(P<0.05);電針組與空白組、假手術(shù)組相比有顯著性差異(P<0.05)。各組大鼠熱痛敏見圖2。2.3各組大鼠、小針組及模型組含量比較從封三彩圖3及圖4可見各組大鼠下丘腦內(nèi)β-EP陽性纖維的密度有所不同,腦內(nèi)β-EP陽性纖維假手術(shù)組、電針組及模型組含量均高于空白組?？瞻捉M含量為0.21±0.05;假手術(shù)組含量為0.37±0.04;電針組含量為0.62±0.02;模型組含量為0.69±0.03。其中模型組與空白組及假手術(shù)組比較差異性顯著(P<0.05),電針組與空白組及假手術(shù)組比較差異性顯著(P<0.05);電針組與模型組比較差異性顯著(P<0.05)。3-內(nèi)啡肽在大鼠腦內(nèi)-ep釋放和激活中的作用本實(shí)驗(yàn)所得行為學(xué)結(jié)果與小鼠骨癌痛時(shí)間點(diǎn)有所區(qū)別。β-EP是機(jī)體的主要的內(nèi)源性阿片肽,在腦內(nèi)主要分布在下丘腦、杏仁核等部位。它的主要功能是使機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下保持平衡,主要調(diào)節(jié)疼痛、心血管和免疫功能。β-EP經(jīng)下丘腦垂體門脈系統(tǒng)進(jìn)入血液中,參與體內(nèi)多種生理活動(dòng),有疼痛、免疫、應(yīng)激、抗心肌缺血以及味覺嗜好等。β-內(nèi)啡肽的鎮(zhèn)痛作用較強(qiáng),因此與鎮(zhèn)痛作用的聯(lián)系最緊密。根據(jù)免疫組化法檢測結(jié)果推測電針可能抑制大鼠腦內(nèi)β-EP的釋放,甚至可能抑制β-EP的合成,使腦內(nèi)的β-EP樣陽性纖維的密度減低,從而減少與腦內(nèi)阿片受體的結(jié)合,以減輕癌癥骨轉(zhuǎn)移帶來的疼痛。癌癥骨轉(zhuǎn)移給患者帶來的疼痛機(jī)制比較復(fù)雜,經(jīng)研究表明與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的β-EP含量有關(guān)。出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移疼痛時(shí)機(jī)體生理機(jī)能降低、微環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡,因而出現(xiàn)各系統(tǒng)功能紊亂,β-EP在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)較為廣泛,其主要作用是針對應(yīng)激時(shí)全身各系統(tǒng)的機(jī)能協(xié)調(diào),起到調(diào)節(jié)機(jī)體的各種生理功能的作用,但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。通過本