針刺對(duì)應(yīng)激性胃黏膜損傷模型大鼠腦-腸軸的影響

針刺對(duì)應(yīng)激性胃黏膜損傷模型大鼠腦-腸軸的影響

正交胃粘膜損傷是一種急性胃粘膜損傷，具有炎癥糜爛、淺表潰瘍和胃腸出血的特點(diǎn)。近年來(lái)的研究表明,針灸不僅能夠促進(jìn)局部胃黏膜損傷修復(fù),還能有效地調(diào)節(jié)整個(gè)機(jī)體的功能狀態(tài),從而促進(jìn)潰瘍的愈合。針刺具有加強(qiáng)胃壁屏障、調(diào)整胃酸分泌的作用,可以使外周血胃泌素減少,胃壁G細(xì)胞內(nèi)胃泌素分泌顆粒增加,提高胃泌素貯存,減少胃泌素釋放,同時(shí)抑制胃壁細(xì)胞泌酸小管的功能,有助抑制胃酸分泌,從而促進(jìn)潰瘍面的愈合。針刺還能使胃潰瘍大鼠胃黏膜組織中6-酮-前列腺素F1α含量大幅度增高,與此同時(shí)血栓素B2含量大幅度下降,并通過(guò)抑制膠原纖維的過(guò)度增生等多途徑達(dá)到促進(jìn)潰瘍修復(fù)的目的。電針“足三里”能增加血漿和胃體黏膜中降鈣素基因相關(guān)肽的含量,對(duì)外周血內(nèi)皮素和一氧化氮含量起到調(diào)節(jié)作用,使血清中超氧化物歧化酶表達(dá)提高、丙二醛表達(dá)降低,減少胃黏膜細(xì)胞凋亡,在促進(jìn)Bcl-2基因表達(dá)的同時(shí)抑制Fas基因表達(dá),從而起到保護(hù)胃黏膜的作用。有研究進(jìn)一步對(duì)胃黏膜損傷大鼠的胃黏膜細(xì)胞進(jìn)行磷酸化抗體蛋白芯片檢測(cè),結(jié)果顯示,電針胃經(jīng)經(jīng)穴對(duì)修復(fù)信號(hào)蛋白的磷酸化水平具有調(diào)節(jié)作用,其中上調(diào)的蛋白參與細(xì)胞的增殖,下調(diào)的蛋白參與抑制細(xì)胞凋亡。以上這些研究基本局限于從局部組織或外周血方面闡釋針灸治療胃黏膜損傷的作用機(jī)制,而對(duì)針灸保護(hù)胃黏膜的神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在從腦-腸軸角度探討針刺在預(yù)防和治療應(yīng)激性胃黏膜損傷中的作用機(jī)制。1材料和方法1.1動(dòng)物的鑒定實(shí)驗(yàn)健康清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只,體質(zhì)量(200±20)g,由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2006-2009。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置遵循中華人民共和國(guó)科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。全部大鼠按相同的飼養(yǎng)條件喂食,自由飲水,適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將動(dòng)物隨機(jī)分為5組:正常組、模型1組(與治療組同期造模)、模型2組(與預(yù)防組同期造模)、治療組、預(yù)防組,每組8只。1.2氣體和標(biāo)準(zhǔn)物β-內(nèi)啡肽(β-EP)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(通用型,美國(guó)生產(chǎn),購(gòu)自北京百事創(chuàng)新科技有限公司),玻璃勻漿器(北京東勝泰博科技有限公司),ER-182A型電子天平、三洋超低溫冰箱(日本制造),ZK38型低溫離心機(jī)(德國(guó)制造)。1.3造模的制作本實(shí)驗(yàn)選用無(wú)水乙醇造成應(yīng)激性胃黏膜損傷模型。除正常組外,其余各組均采用無(wú)水乙醇灌胃的方法造模。大鼠禁食不禁水36h后,抓取固定,用前段潤(rùn)滑的灌胃針(長(zhǎng)約15cm)經(jīng)口探入至賁門(mén)部(至賁門(mén)部時(shí)有落空感),緩慢注入無(wú)水乙醇1mL,1h后模型形成。1.4針刺治療組“內(nèi)關(guān)”“中蝌蚪”的方法應(yīng)激性胃黏膜損傷當(dāng)屬中醫(yī)的“胃痛”“吐酸”等范疇,治宜和胃止痛。穴選雙側(cè)“足三里”“內(nèi)關(guān)”及“中脘”,用0.25mm×25mm不銹鋼毫針刺入5～10mm,留針20min,每5min捻轉(zhuǎn)行針1次,每次持續(xù)30s。治療組于造模后第1天開(kāi)始針刺治療,連續(xù)5d;預(yù)防組連續(xù)治療5d后再開(kāi)始造模。1.5移液槍提取法實(shí)驗(yàn)結(jié)束后所有大鼠同時(shí)取材。先用灌胃針將10%炭粉與水做成的混懸液按0.5mL/只灌胃,1h后快速斷頭,取血、取腦、取胃。取血:斷頭取血至加有肝素抗凝的離心管中,4℃離心20min(3000r/min),用移液槍收集上清液(如有沉淀形成,應(yīng)再次離心)至EP管中,放入冰箱-80℃保存,用于測(cè)定血漿β-EP的含量。取腦:大鼠斷頭后,迅速取出腦組織,放于冰塊上,剝離下丘腦,濾紙擦拭干凈,放電子天平稱(chēng)重,然后將組織放入封閉好的EP管中,投入液氮中冷卻。將組織放入勻漿管中,用移液槍按1∶9的比例加入生理鹽水,進(jìn)行勻漿。將勻漿液放入EP管中,放入離心機(jī)中,以3000r/min離心15min,取上清,放入-70℃冰箱中待測(cè)下丘腦中的β-EP含量。取胃:處死大鼠,迅速打開(kāi)腹腔,先取賁門(mén)至肛門(mén)部的消化管測(cè)量胃腸推進(jìn)百分率,然后取胃,沿胃大彎剪開(kāi),以生理鹽水沖洗,進(jìn)行胃黏膜形態(tài)觀察,用游標(biāo)卡尺測(cè)定潰瘍?cè)畲笮?計(jì)算黏膜損傷指數(shù)。1.6組織形態(tài)觀察和血漿-ep的測(cè)定炭粉推進(jìn)百分率(胃腸推進(jìn)百分率)計(jì)算:自賁門(mén)至肛門(mén)部的消化管不加牽引地平鋪于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,測(cè)其全長(zhǎng)和炭末前沿至賁門(mén)的距離,計(jì)算胃腸推進(jìn)百分率。胃腸推進(jìn)百分率=炭粉在胃腸內(nèi)的推進(jìn)距離/賁門(mén)至肛門(mén)的總長(zhǎng)度×100%。胃組織形態(tài)觀察:把剪開(kāi)的胃展平于平板上,對(duì)胃組織黏膜進(jìn)行肉眼觀察,并拍照。胃黏膜損傷指數(shù)測(cè)定:采用Guth法,斑點(diǎn)糜爛計(jì)1分,糜爛長(zhǎng)度<1mm計(jì)2分,1～2mm計(jì)3分,2～3mm計(jì)4分,>4mm計(jì)5分,糜爛寬度>1mm時(shí)分值×2。血漿和下丘腦β-EP的測(cè)定:按照酶聯(lián)免疫測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品、100μL標(biāo)本于相應(yīng)反應(yīng)板孔中,輕輕混勻30s,封住板孔,37℃溫育90min。然后經(jīng)洗板、生物素及辣根過(guò)氧化物酶溫育、顯色等步驟,在450nm處讀吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)樣品的吸光度值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出其濃度。1.7均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)用SPSS10.0軟件進(jìn)行處理,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。各組間比較采用單因素方差分析,繼以LSD檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1組患者的胃腸推進(jìn)百分率的比較由圖1可見(jiàn),與正常組比較,模型1組、模型2組、治療組的胃腸推進(jìn)百分率顯著降低(P<0.05);與模型1組比較,治療組的胃腸推進(jìn)百分率變化不明顯(P>0.05);與模型2組比較,預(yù)防組的胃腸推進(jìn)百分率顯著提高(P<0.05);模型1組與模型2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);預(yù)防組的胃腸推進(jìn)百分率明顯高于治療組(P<0.05)。說(shuō)明乙醇造成的胃黏膜損傷大鼠胃腸功能降低,預(yù)防性治療的效果優(yōu)于疾病發(fā)生后再進(jìn)行治療。2.2胃黏膜損傷指數(shù)見(jiàn)圖2。正常組胃黏膜呈淡紅色,表面光滑,可見(jiàn)黏膜皺壁,黏膜上皮完整。模型1組和2組均見(jiàn)胃黏膜損傷,表現(xiàn)為大面積水腫及點(diǎn)、線(xiàn)狀出血,黏膜皺壁變淺或消失,部分胃黏膜缺失并伴有出血,形成潰瘍;模型1組損傷程度較模型2組稍輕。治療組和預(yù)防組胃黏膜出血點(diǎn)明顯少于模型1組和2組,黏膜水腫較輕,部分接近正常。各造模組胃黏膜損傷指數(shù)均高于正常組(P<0.05,P<0.01);與模型1組相比,治療組的胃黏膜損傷指數(shù)明顯降低(P<0.05);與模型2組相比,預(yù)防組的胃黏膜損傷指數(shù)顯著降低(P<0.01);模型2組的胃黏膜損傷指數(shù)高于模型1組(P<0.05);治療組與預(yù)防組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說(shuō)明乙醇灌胃可以引起應(yīng)激性胃黏膜損傷,而這種損傷又有一定的自愈性,因此造模結(jié)束當(dāng)天取材的模型2組胃黏膜損傷指數(shù)高于數(shù)天前造模的模型1組;針刺防治均可以有效減輕胃黏膜的損傷程度。2.3治療及預(yù)防組血漿-ep含量比較由圖3可見(jiàn),與正常組相比,模型1組和2組血漿β-EP含量顯著升高(P<0.01);與模型1組相比,治療組血漿β-EP含量降低(P<0.05);與模型2組相比,預(yù)防組血漿β-EP含量顯著降低(P<0.01);治療組、預(yù)防組與正常組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩模型組相比及治療組和預(yù)防組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.4組治療組和預(yù)防組人群p-ep含量比較由圖4可見(jiàn),與正常組相比,其余4組大鼠下丘腦中β-EP的含量均升高(P<0.01);治療組與模型1組相比、預(yù)防組與模型2組相比,下丘腦中β-EP含量均進(jìn)一步升高(P<0.01);兩模型組相比及治療組和預(yù)防組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3應(yīng)激性胃黏膜損傷的作用機(jī)制現(xiàn)代研究認(rèn)為,神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸功能的調(diào)節(jié)通過(guò)3個(gè)層次相互協(xié)調(diào)來(lái)實(shí)現(xiàn):第1層次是腸神經(jīng)系統(tǒng)局部的調(diào)控;第2層次位于椎前神經(jīng)節(jié),接受并且調(diào)控來(lái)自腸神經(jīng)以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息,起到中介作用;第3層次是中樞神經(jīng)系統(tǒng),由腦的各級(jí)中樞和脊髓接受環(huán)境變化時(shí)傳入的信息,經(jīng)過(guò)整合,又由植物神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)將其調(diào)控信息傳送到腸神經(jīng)系統(tǒng)。這種在不同層次將胃腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)緊密聯(lián)系起來(lái)的神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)稱(chēng)為腦-腸軸。形成應(yīng)激性黏膜損傷的基本條件是胃酸分泌過(guò)度。在應(yīng)激狀態(tài)下,下丘腦調(diào)控垂體等內(nèi)分泌腺體會(huì)出現(xiàn)功能障礙,胃黏膜微循環(huán)障礙,黏膜表面上皮層抗酸屏障受損,迷走神經(jīng)興奮性異常增高,壁細(xì)胞被激活,胃黏膜內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物含量升高和氧自由基產(chǎn)生增加,最終導(dǎo)致應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生。潘氏等研究針刺對(duì)胃黏膜保護(hù)作用與植物性神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系。結(jié)果表明,電針雙側(cè)“足三里”抑制了大鼠胃體腎上腺素能神經(jīng)活動(dòng),使胃壁交感神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素釋放減少,同時(shí)膽堿能神經(jīng)活動(dòng)在電針的作用下,由開(kāi)始時(shí)的局部興奮轉(zhuǎn)為全面抑制,從而使致潰瘍因素減弱,有利于黏膜保護(hù)。黃氏等觀察切斷膈下迷走神經(jīng)或切除腹腔交感神經(jīng)節(jié),注射受體阻斷劑對(duì)電針“足三里”抗應(yīng)激性胃黏膜損傷的影響。結(jié)果表明,電針對(duì)應(yīng)激性胃黏膜損傷的保護(hù)作用是通過(guò)對(duì)迷走神經(jīng)和交感神經(jīng)的調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)的,其中主要是β受體參與介導(dǎo),而與M受體、α受體關(guān)系不大。嚴(yán)氏等針刺“足三里”等穴后,發(fā)現(xiàn)其傳入沖動(dòng)能到達(dá)初級(jí)中樞腦干最后區(qū)、孤束核等特定結(jié)構(gòu),激活肽能神經(jīng)和神經(jīng)遞質(zhì),其傳出沖動(dòng)則可激活外周腸神經(jīng)系統(tǒng)P物質(zhì)、胃泌素、胃動(dòng)素等肽能神經(jīng)元,啟動(dòng)胃腸收縮活動(dòng),增強(qiáng)胃黏膜細(xì)胞的保護(hù)作用。這些研究從神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)胃腸功能調(diào)節(jié)的不同層次證實(shí)了針刺在保護(hù)胃黏膜中的作用。本實(shí)驗(yàn)仍以腦-腸軸為主線(xiàn),進(jìn)一步探討神經(jīng)肽類(lèi)物質(zhì)在針刺預(yù)防及治療胃黏膜損傷疾病中的效應(yīng)。β-EP是體內(nèi)活性最強(qiáng)的應(yīng)激性神經(jīng)肽之一,參與體內(nèi)多種生理活動(dòng),涉及疼痛、免疫與應(yīng)激調(diào)節(jié)等諸多方面,其作用是使機(jī)體在不同應(yīng)激條件下保持穩(wěn)態(tài)。有研究表明,不同原因引起的應(yīng)激狀態(tài)以不同途徑刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸,致使內(nèi)環(huán)境受到不同的影響,β-EP可應(yīng)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的需要大量增加,具有啟動(dòng)機(jī)體防御機(jī)制的作用。但中樞和外周β-EP對(duì)胃黏膜的作用是不同的,可能與其作用的部位及受體不同有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),中樞給予β-EP可減輕應(yīng)激大鼠的胃黏膜損傷,這一作用可能與其刺激自主神經(jīng),使支配腎上腺髓質(zhì)的交感神經(jīng)活性增高,導(dǎo)致胃酸分泌減少有關(guān)。而外周血中的β-EP能夠抑制ATP向腺苷酸環(huán)化酶的轉(zhuǎn)化,進(jìn)而抑制前列腺素生成,使前列腺素與血栓素之間的平衡失調(diào),后者具有強(qiáng)烈縮血管作用,從而引發(fā)胃黏膜缺血、缺氧。本實(shí)驗(yàn)觀察到,模型組大鼠血漿及下丘腦中β-EP含量均顯著升高,表明乙醇造成的胃黏膜損傷使大鼠機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài);針刺干預(yù)在增強(qiáng)胃腸功能、減輕胃黏膜損傷的同時(shí)降低了外周血中β-EP含量,并增加了下丘腦中β-EP的含量,與上述β-EP在中樞及外周血中不同變化對(duì)胃黏膜所發(fā)揮的保護(hù)作用機(jī)制相符。另外,下丘腦中β-EP參與了針刺鎮(zhèn)痛過(guò)程,胃黏膜損傷大鼠存在機(jī)體的疼痛,針刺干預(yù)使下丘腦中β-EP含量增高也是其改善疾病癥狀的作用途徑之一。本實(shí)驗(yàn)選取的穴位是“足三里”“中脘”“內(nèi)關(guān)”。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)之合穴,胃下合穴,有理脾胃、調(diào)氣血、補(bǔ)虛弱之功;中脘為任脈穴,為胃之募穴,八會(huì)穴之腑會(huì),可健運(yùn)中州,調(diào)理氣