藥用真菌代用品發(fā)酵工藝的研究

藥用真菌代用品發(fā)酵工藝的研究

現(xiàn)在已知的醫(yī)療真菌主要分布在毛囊菌和擔子菌的亞門。擔子菌亞門的藥用真菌種數(shù)約占藥用真菌的90%,其中70%藥用真菌集中在多孔菌科?！吨袊幍洹?010年版收載的藥用真菌有冬蟲夏草Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.、赤芝Ganodermalucidum(Leyss.exFr.)Karst.、紫芝G.sinenseZhao,XuetZhang、豬苓Polyporusumbellatus(Pers.)Fries、脫皮馬勃LasiosphaerafenzliiReich.、大馬勃Calvatiagigantea(BatschexPers.)Lloyd、紫色馬勃C.lilacina(Mont.etBerk.)Lloyd、茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf、雷丸OmphalialapidescensSchroet.9種。常用的藥用真菌還有蛹蟲草Cordycepsmilitaris(L.)Link、黑木耳Auriculariaauricula(L.exHook.)Underw.、云芝Coriolusversicolor(L.:Fr.)Quel.、桑黃Phellinusigniarius(L.ex.Fr)Quel.、灰樹花Grifolafrondosa(Dicks.exFr.)S.F.Gray、竹黃ShiraiabambusicolaP.Henn.、密環(huán)菌Armillariamucida(Schrad.exFr.)Quel.、羊肚菌Morehellaesculenta(L.)Pers.、猴頭菌Hericiumerinaceus(Bull.exFr.)Pers.、銀耳TremellafuciformisBerk.、樟芝AntrodiacinnamomeaChangetChou、樹舌G.applanatum(Pers.)Pat.等。藥用真菌已廣泛地應用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的科學研究。除野生采集和人工栽培藥用真菌外,還可采用發(fā)酵工程等現(xiàn)代生物技術(shù)進行藥用真菌液體發(fā)酵,大規(guī)模、高效率地工業(yè)化生產(chǎn)藥用真菌菌絲體。盡管藥用真菌液體發(fā)酵具有不受季節(jié)和地域影響,可連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn),生產(chǎn)時間大大少于野生或人工栽培所需時間等優(yōu)點,但也存在如何有效提高藥用真菌液體發(fā)酵水平及科學評價藥用真菌液體發(fā)酵質(zhì)量的問題,從而嚴重地制約了藥用真菌液體發(fā)酵的應用。本文就目前藥用真菌液體發(fā)酵的應用狀況,結(jié)合筆者多年來在茯苓液體發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)的問題及解決方法進行綜述和討論,以期為藥用真菌液體發(fā)酵的進一步研究提供參考。1藥用真菌的利用技術(shù)大多藥用真菌因為受生理生態(tài)特殊性及環(huán)境條件制約,其野生子實體稀少,人工栽培難度較大,給生態(tài)環(huán)境及資源保護也造成了較大的壓力,嚴重地影響了藥用真菌的開發(fā)利用。應用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)藥用真菌代用品為解決上述難題提供了一條新途徑。目前,針對靈芝、冬蟲夏草、蛹蟲草、黑木耳、云芝、桑黃、灰樹花、茯苓、竹黃、豬苓、密環(huán)菌、羊肚菌、猴頭菌、樟芝和樹舌等藥用真菌的液體發(fā)酵均有研究報道[4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]。本文圍繞藥用真菌的發(fā)酵條件、發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工程菌的研究進展進行綜述。1.1用藥真菌液體發(fā)酵的確定為了提高藥用真菌的液體發(fā)酵水平,獲得更多的藥用真菌菌絲體或發(fā)酵產(chǎn)物,應加強藥用真菌生長代謝規(guī)律的基礎研究,優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件,加強對發(fā)酵過程的動態(tài)監(jiān)控。發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化主要涉及到發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖瓶裝量、攪拌速度、種子液接種量、種子液菌齡、發(fā)酵時間等參數(shù)的優(yōu)化。其中,發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值、搖瓶裝量、攪拌速度是最關(guān)鍵的4個參數(shù),其參數(shù)值選擇是否得當對于藥用真菌的液體發(fā)酵至關(guān)重要。發(fā)酵條件的優(yōu)化對藥用真菌液體發(fā)酵的菌絲體產(chǎn)量將產(chǎn)生重要影響。任丹等在單因素試驗的基礎上,應用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設計確定了紫芝最佳液體發(fā)酵條件:裝液量90mL,pH6.0,轉(zhuǎn)速140r/min,培養(yǎng)溫度27℃,接種量10.5%。此時紫芝的最大生物量達3.15g,驗證試驗結(jié)果與模型值相符。蔡德華等對猴頭菌搖瓶培養(yǎng),研究培養(yǎng)條件對猴頭菌菌絲體產(chǎn)量的影響,認為最適培養(yǎng)條件為搖瓶培養(yǎng)基裝量50~70mL,接種量10%,pH5.0。發(fā)酵條件的優(yōu)化對藥用真菌液體發(fā)酵的發(fā)酵產(chǎn)物表達量也將產(chǎn)生重要影響。牛廣財?shù)仍趩我蛩卦囼灥幕A上,采用Box-Behnken設計和響應面分析法對培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,確定了桑黃菌產(chǎn)胞外多糖的最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件:溫度26.3℃,搖床轉(zhuǎn)速162r/min,裝液量81.4mL(250mL三角瓶),接種量16.0%;在此培養(yǎng)條件下,胞外多糖平均可達1.866g/L。郎久義等研究了冬蟲夏草液體發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的實驗條件,認為接種量10%,培養(yǎng)溫度24℃,發(fā)酵周期5d,搖床轉(zhuǎn)速140r/min為最適培養(yǎng)條件;在此培養(yǎng)條件下,發(fā)酵液中蟲草多糖質(zhì)量濃度達到3.928g/L。1.2發(fā)酵培養(yǎng)基1.2.1最佳培養(yǎng)基的確定藥用真菌培養(yǎng)基的組成,特別是培養(yǎng)基中碳源和氮源種類及其比對液體發(fā)酵水平高低有重要影響。另外,培養(yǎng)基中微量元素對藥用真菌液體發(fā)酵也有影響,特別是K、Mg等微量元素對藥用真菌菌絲體產(chǎn)量和發(fā)酵產(chǎn)物表達量均有較大的影響。通過單因素、正交試驗或響應面等方法優(yōu)化藥用真菌發(fā)酵培養(yǎng)基,篩選出最適發(fā)酵培養(yǎng)基。楊德等比較了單一碳源(葡萄糖、麥芽糖、蔗糖)和復合碳源(玉米粉及其與單糖的組合)對靈芝液體發(fā)酵菌絲生長及生物量和多糖量的影響。結(jié)果表明,以玉米粉水解液發(fā)酵得到的靈芝菌絲體生物量最大,但菌絲中多糖量較低。綜合幾種培養(yǎng)基來看,以玉米粉為液體發(fā)酵主料,配以蔗糖、麥芽糖等單糖的培養(yǎng)基為靈芝液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基,獲得的多糖量最大。祝明思等在單因素試驗的基礎上,采用Box-Behnken設計和響應面法對碳源、氮源、維生素對桑黃菌絲體產(chǎn)量的影響進行分析,確定了其最佳液體培養(yǎng)基為玉米淀粉0.5%、酵母膏0.1%、維生素B0.1%,培養(yǎng)時間6d,結(jié)果每升液體培養(yǎng)基中桑黃菌絲體干質(zhì)量為18.43g。鐘石等以桑黃菌絲體干質(zhì)量為評價指標,篩選并優(yōu)化確定了其最適培養(yǎng)基為麥芽糖3%、酵母粉2%、MgSO40.15%、KH2PO40.10%、檸檬酸三銨0.10%、復合維生素B0.01%,其每升培養(yǎng)基中菌絲體干質(zhì)量達20.23g。毛永強等以菌絲體干質(zhì)量為指標,通過單因素和正交試驗確定了冬蟲夏草液體發(fā)酵最適培養(yǎng)基組成為葡萄糖2.0%、蛋白胨4.0%、KH2PO40.20%、MgSO40.10%,在該條件下每毫升培養(yǎng)基中菌絲體干質(zhì)量平均可達15.64mg。王廣耀等采用單因素試驗,優(yōu)選出適合羊肚菌液體培養(yǎng)的碳、氮源分別是麥芽糖和酵母膏;通過正交試驗優(yōu)化了其液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其最適液體發(fā)酵培養(yǎng)基為麥芽糖3.0%、酵母膏4.0%、MgSO40.1%、KH2PO40.15%。1.2.2補料發(fā)酵的研究初始碳源或氮源濃度對茯苓液體發(fā)酵有較大影響,濃度過高或過低都將抑制藥用真菌生長。在對茯苓液體發(fā)酵的研究中,發(fā)現(xiàn)初始葡萄糖濃度或氮源濃度對發(fā)酵有一定的影響,發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的相對穩(wěn)定更有利于茯苓的液體發(fā)酵。因此,應根據(jù)茯苓液體發(fā)酵過程中碳源和氮源消耗速率適時地補充碳、氮源來提高其液體發(fā)酵的水平。李羿等研究了不同時間的不同補料方式對茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵菌絲體產(chǎn)量、胞外多糖產(chǎn)量和發(fā)酵終點的影響,確定了最佳的發(fā)酵工藝:初始葡萄糖濃度為2%,初始氮源濃度為0.05%,在發(fā)酵培養(yǎng)第48、60、72、84h時,分別以0.33%、0.67%、0.67%、0.33%的葡萄糖濃度及0.0167%、0.0167%、0.0083%、0.0083%的氮源濃度補料,發(fā)酵時間為117h。在最佳發(fā)酵工藝下,菌絲體干質(zhì)量達12.56g/L,較不補料發(fā)酵罐液體發(fā)酵時菌絲體干質(zhì)量提高了14.39%。1.2.3中藥中不同中藥對發(fā)酵飲料的活性研究每種中藥材都含有數(shù)百種不同的化學成分,不同化學成分對藥用真菌生長代謝有抑制或促進作用。在營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加適量中藥材構(gòu)成藥性培養(yǎng)基,其中的化學成分將對藥用真菌生長代謝產(chǎn)生重要的影響。對藥用真菌藥性培養(yǎng)基的研究越來越備受關(guān)注。鐘石等在桑黃最適培養(yǎng)基中添加0.3%桑枝水提物可促進其菌絲體生物量的增加,菌絲體干質(zhì)量高達24.78g/L。朱強等通過在靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加甘草、山茱萸、黃芪和黃芩,研究其對靈芝液體發(fā)酵的影響。結(jié)果表明,甘草和山茱萸對靈芝的液體發(fā)酵有明顯的促進作用,黃芪表現(xiàn)一定的促進作用和抑制作用,黃芩則有較強的抑制作用;除黃芩外,靈芝生物量及各代謝產(chǎn)物量達到最大值時其余3種中藥的添加量范圍均在4~8g/L,其中,甘草更利于促進靈芝酸(尤其是胞外靈芝酸)的合成,山茱萸不僅能促進靈芝快速生長,而且更利于促進靈芝多糖(尤其是胞外靈芝多糖)的合成。楊海龍等研究了以薏苡仁為基質(zhì)的靈芝液體發(fā)酵,研究結(jié)果表明最適培養(yǎng)基中薏苡仁的量為3.59%,薏苡仁可促進靈芝的生長和胞外多糖的分泌。陳麗華等研究不同中藥對黑木耳液體培養(yǎng)中生物量的影響,并對添加不同中藥的黑木耳發(fā)酵液的體外活性進行了比較。結(jié)果表明,丹參和絞股藍抑制黑木耳的生長;決明子對黑木耳的生物量沒有大的影響;紅曲、銀杏葉、何首烏、葛根和苦蕎均能促進黑木耳的生長。體外活性試驗結(jié)果顯示,在黑木耳發(fā)酵過程中添加何首烏、銀杏葉和決明子能增強黑木耳的調(diào)血脂功效。李羿等考察了薏苡仁、黃芪、金銀花、甘草、淡竹葉、桑葉、丹參、靈芝和枸杞子9味中藥對茯苓搖瓶液態(tài)發(fā)酵的影響,黃芪、金銀花和丹參對茯苓的菌絲體生長有抑制作用,而其余6味中藥則對茯苓的菌絲體生長有促進作用,其中以薏苡仁的促進作用最為顯著。改變薏苡仁添加量,分別按0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.5%和2.0%比例將薏苡仁粉末加入營養(yǎng)培養(yǎng)基中,研究不同薏苡仁添加量對茯苓搖瓶液體發(fā)酵的菌絲體產(chǎn)量的影響。研究表明,營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加0.75%薏苡仁,茯苓菌絲體干質(zhì)量最高達14.41g/L,較未添加薏苡仁搖瓶液體發(fā)酵時菌絲體干質(zhì)量提高了22.53%。1.3原生質(zhì)體融合菌株的篩選及擴增優(yōu)良的藥用真菌工程菌是提高藥用真菌液體發(fā)酵水平的關(guān)鍵。目前,對藥用真菌采用的育種手段主要有自然選擇、誘變育種和雜交育種。除利用紫外線、激光和化學誘變劑等物理化學誘變因素來篩選出優(yōu)良藥用真菌外,為了提高藥用真菌育種的有效性和目的性,研究人員越來越重視利用原生質(zhì)體融合技術(shù)、基因重組技術(shù)等來構(gòu)建新型的藥用真菌發(fā)酵工程菌。原生質(zhì)體融合又稱細胞融合,該技術(shù)不受親合因子的影響,可實現(xiàn)藥用真菌的種內(nèi)不同品種間、種間以及屬間細胞中的全基因組的有效混合,使遺傳距離較大的遠緣種間、屬間雜交成為可能。但由于雜合子鑒定標準上存在著技術(shù)難度而影響了該技術(shù)的廣泛應用。邱文娜等對桑黃原生質(zhì)體融合菌株進行液體培養(yǎng),測定各菌株的生物量及發(fā)酵液中胞外多糖量、總黃酮量、酯酶活性及pH值。研究結(jié)果表明,融合菌株與親本具有共同的基礎條帶,同時還產(chǎn)生了自身特異性條帶,融合菌株SR002、SR003菌絲生物量是親本SA04的3倍。SR005菌株合成胞外多糖速率最快,但SR002菌株胞外多糖產(chǎn)量最高,較親本SA02增加到1.8倍。融合菌株SR005在培養(yǎng)后期發(fā)酵液中酯酶活性最高。SR002、SR003兩菌株親緣關(guān)系極為相近。篩選得到的SR002茵株經(jīng)進一步遺傳穩(wěn)定性驗證后可用于以獲得生物量、胞外多糖為目的的液體發(fā)酵培養(yǎng)。曾念開等采用雙滅活標記,原生質(zhì)體PEG誘導融合的方法,初步篩選出生長速度快的鮑氏針層孔菌菌株SA04,液體發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和胞外多糖產(chǎn)量高的鮑氏針層孔菌菌株SA02。原生質(zhì)體融合缺乏對所需基因的選擇,因此,藥用真菌基因工程育種的研究越來越受到關(guān)注,并且在理論和應用上均取得了較大進展。利用基因工程重組技術(shù)將2種或2種以上藥用真菌的優(yōu)良基因克隆到1個工程菌中,構(gòu)建出新型高效的藥用真菌發(fā)酵工程菌。新型高效藥用真菌發(fā)酵工程菌必將給藥用真菌液體發(fā)酵帶來變革。2藥用真菌液體發(fā)酵的優(yōu)化目前已在藥用真菌發(fā)酵培養(yǎng)基和藥性培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、發(fā)酵工藝的放大、補料發(fā)酵工藝的優(yōu)化及優(yōu)良發(fā)酵工程菌的選育等方面取得了一定的研究成果,提高了藥用真菌液體發(fā)酵的水平,但仍存在如何提高藥用真菌的液體發(fā)酵水平和科學評價藥用真菌液體發(fā)酵質(zhì)量的問題,上述問題如不能有效解決將嚴重制約藥用真菌液體發(fā)酵的應用。2.1藥用真菌液體發(fā)酵的最佳用量提高藥用真菌的液體發(fā)酵水平,即提高發(fā)酵藥用真菌的質(zhì)(藥用真菌菌絲體中活性成分的量高,藥理作用強)、量(藥用真菌菌絲體的生物量高)和穩(wěn)定性(不同批次藥用真菌液體發(fā)酵的質(zhì)和量一致性)。針對上述問題,筆者以茯苓液體發(fā)酵為例提出解決措施。2.1.1茯苓液體發(fā)酵工藝研究提高發(fā)酵茯苓的質(zhì)量關(guān)鍵在于最適培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化,以及最適培養(yǎng)條件的優(yōu)化。而對培養(yǎng)基或藥性培養(yǎng)基的篩選由于缺乏科學理論指導,存在隨機性較強和篩選效率不高的問題。因此,筆者擬以中藥方劑理論為指導,結(jié)合藥效學實驗來提高藥性培養(yǎng)基的篩選效率。通過加入1種中藥(如薏苡仁或白術(shù))或數(shù)味中藥(如人參、白術(shù)、甘草)可以增加茯苓液體發(fā)酵菌絲體的產(chǎn)量,提高藥效成分的量,增強藥理作用。藥物“七情和合”中的“相須”是指性能功效相似的藥物配合應用,可增強其原有功效;中藥復方以其配伍嚴謹、療效顯著著稱,而經(jīng)方更是千余年用之不衰。鑒于薏苡仁、白術(shù)、茯苓均具有利水、滲濕、健脾的功效,選取常見茯苓藥對白術(shù)及經(jīng)方四君子湯(白術(shù)、茯苓、甘草和人參,其他3味藥按四君子湯的用藥比例)添加到營養(yǎng)培養(yǎng)基中構(gòu)成藥性培養(yǎng)基,以添加薏苡仁的藥性培養(yǎng)基為對照(薏苡仁對茯苓菌絲體生長的促進作用最為顯著),進行茯苓搖瓶液體發(fā)酵?？疾煸诓煌幮耘囵B(yǎng)基中茯苓搖瓶液體發(fā)酵后藥性發(fā)酵茯苓(薏苡仁配伍發(fā)酵茯苓、白術(shù)配伍發(fā)酵茯苓、四君子湯配伍發(fā)酵茯苓)的菌絲體干質(zhì)量,結(jié)合增強免疫、抗疲勞、利尿、抗腫瘤的藥效學實驗來評價其藥效,采用多指標、多種評價手段,證明相對于薏苡仁配伍液體發(fā)酵,白術(shù)配伍發(fā)酵和四君子湯配伍發(fā)酵所得藥性發(fā)酵茯苓在菌絲體干質(zhì)量、藥效成分量、藥理作用方面均顯示出優(yōu)勢。白術(shù)配伍發(fā)酵和四君子湯配伍發(fā)酵體現(xiàn)了傳統(tǒng)中藥方劑配伍理論中的相須配伍和根據(jù)病癥特點所體現(xiàn)出來的方劑君、臣、佐、使整體協(xié)同的特點。筆者將傳統(tǒng)中藥配伍理論應用到茯苓液體發(fā)酵過程中,提出了一種基于中藥方劑理論的中藥配伍發(fā)酵液體發(fā)酵理論,也為其他藥用真菌的液體發(fā)酵提供理論指導。在此基礎上,發(fā)酵條件和補料發(fā)酵工藝的優(yōu)化將進一步提高發(fā)酵茯苓的質(zhì)量。2.1.2發(fā)酵罐液體發(fā)酵動力學特性研究不同批次液體發(fā)酵的茯苓質(zhì)和量一致性的關(guān)鍵是液體發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性,實現(xiàn)液體發(fā)酵工藝穩(wěn)定性的關(guān)鍵是適時動態(tài)調(diào)控茯苓的液體發(fā)酵,而要實現(xiàn)液體發(fā)酵的適時動態(tài)調(diào)控又必需以加強茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵動力學特性的研究為基礎。邵偉等對灰樹花液體發(fā)酵動力學特性進行了初步研究,建立了灰樹花液體發(fā)酵過程中菌體生長、胞外多糖合成、基質(zhì)消耗的動力學模型,為實現(xiàn)其發(fā)酵過程的優(yōu)化打下了基礎。因此,筆者擬采用Origin6.0數(shù)據(jù)處理軟件分析實驗數(shù)據(jù),通過Logistic方程建立發(fā)酵罐液體發(fā)酵菌體生長、基質(zhì)消耗的動力學模型,比較模型計算值與實驗數(shù)據(jù)的擬合度,完成茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵動力學特性的研究,通過發(fā)酵過程的計算機在線控制實現(xiàn)對液體發(fā)酵的適時動態(tài)的調(diào)控,從而保證茯苓液體發(fā)酵的穩(wěn)定性。2.2茯苓質(zhì)的測定問題針對藥用真菌液體發(fā)酵質(zhì)量難以科學評價的問