五倍子提取物提取液抗鼻咽癌的生物活性及其分子機(jī)制研究

五倍子提取物提取液抗鼻咽癌的生物活性及其分子機(jī)制研究

肛門腫瘤是中國南方最常見的腫瘤，容易早期感染和轉(zhuǎn)移。根治性放療后,復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重危害著人民的健康和生命。因此,尋找有效的方法防治鼻咽癌有非常重要的意義。鞣花酸(ellagicacid)是五倍子和石榴皮等植物組織中的一種天然多酚,化學(xué)成分為沒食子酸二聚衍生物的多酚二內(nèi)酯,呈反式?jīng)]食子酸單寧結(jié)構(gòu),以游離或二聚體的形式存在,具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗菌等生物學(xué)活性。近年來,鞣花酸抗腫瘤和炎癥的作用引起學(xué)者的廣泛關(guān)注,鞣花酸對多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用,但其對鼻咽癌的生物學(xué)作用的報道卻不多。本文研究鞣花酸抗鼻咽癌的生物學(xué)活性,初步探討其抗鼻咽癌作用的分子機(jī)制。1材料和方法1.1免疫組化檢測人鼻咽癌5-8F細(xì)胞株(來源于桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實驗中心);五倍子提取物鞣花酸(美國Alfa公司);RPMI1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國Gibco公司);胰蛋白酶、甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma公司);兔抗人stathmin抗體,兔抗人環(huán)氧化酶(COX-2)抗體(美國Bioworld公司);PVDF膜(美國Millipore公司);小鼠抗人β-actin抗體,辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技術(shù)有限公司);BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。1.2方法1.2.1完全培養(yǎng)基20%k人鼻咽癌5-8F細(xì)胞株接種于RPMI1640完全培養(yǎng)基(含10%小牛血清,100U/mL青霉素,100μg/mL鏈霉素),置37℃,5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.2實驗組實驗設(shè)對照組和實驗組,實驗組設(shè)3個藥物濃度組(2,4,6μg/mL),對照組不用藥物處理。1.2.3生長抑制率的測定采用0.25%胰蛋白酶消化鼻咽癌細(xì)胞,細(xì)胞以2×104個/mL接種于96孔板,200μL/孔。第2天更換培養(yǎng)液,加入實驗設(shè)計鞣花酸濃度,每組設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)48h后,移去培養(yǎng)液,每孔加200μL無血清的培養(yǎng)液,20μLMTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4h后,棄去上清,加二甲基亞砜(DMSO)200μL/孔,避光振蕩10min,待結(jié)晶體充分溶解后,利用酶標(biāo)儀(490nm)測定各孔的吸光度值(OD值),計算細(xì)胞的生長抑制率。1.2.4花酸酯的合成用0.25%胰酶消化5-8F細(xì)胞,細(xì)胞按8×104個/孔接種于6孔板,培養(yǎng)過夜后,更換培養(yǎng)液,加入設(shè)定的鞣花酸濃度,培養(yǎng)48h,PBS洗2次,4%的多聚甲醛室溫固定20min,PBS洗2次。然后,加入Hoechst33258熒光染料,染色10min。置倒置相差熒光顯微鏡下觀察并采圖。1.2.5流式細(xì)胞周期檢測5-8F細(xì)胞接種于50mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,培養(yǎng)過夜后更換培養(yǎng)液。各組設(shè)3個復(fù)孔,按所設(shè)濃度分別加入鞣花酸,培養(yǎng)48h,收集各組細(xì)胞,1000r/min離心5min,PBS洗2次,用70%預(yù)冷乙醇懸浮細(xì)胞,4℃固定24h后,PBS洗2次,加入20μLRNaseA,37℃水浴30min,懸浮于1mLPI染液中,PI終濃度為50μg/mL,4℃避光30min后,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。1.2.6總蛋白表達(dá)情況收集藥物處理48h后的各組細(xì)胞,蛋白裂解液裂解細(xì)胞,置冰上15min,超聲波處理后,12000r/min,4℃離心30min;分離上清液,采用BCA法測定上清液總蛋白濃度。取上清液總蛋白50μg與上樣緩沖液混合,置沸水浴5~10min;然后,上樣進(jìn)行電泳,電泳完畢后,采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜;5%脫脂奶粉(TBST配置)封閉1h,加入一抗(1:500),30℃搖蕩2h(或4℃過夜),TBST洗膜4次,5min/次,加入HRP標(biāo)記的二抗,30℃,搖蕩2h,TBST洗膜4次,5min/次,采用ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光,X線片壓片、顯影、定影。1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ue0af±s)表示,多組資料比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞抑制率比較五倍子提取物鞣花酸處理鼻咽癌5-8F細(xì)胞48h后,2,4和6μg/mL藥物處理組細(xì)胞增殖均受到明顯抑制,抑制率分別為(29.35±4.95)%,(53.32±4.44)%和(61.75±6.93)%,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),細(xì)胞抑制呈劑量依賴性。2.2兩組細(xì)胞數(shù)量不同Hochest33258染色顯示:對照組細(xì)胞均一,呈藍(lán)色,細(xì)胞數(shù)量較多。實驗組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,強(qiáng)藍(lán)染的核濃縮和碎裂凋亡細(xì)胞增多(圖1)。2.3細(xì)胞長期阻滯試驗2,4和6μg/mL鞣花酸處理細(xì)胞48h,處于S期的細(xì)胞百分率分別為(25.47±0.74)%,(28.08±1.41)%和(35.49±0.66)%,與對照組(21.26±0.70)%比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),細(xì)胞明顯阻滯于S期(圖2)。2.4嘗試添加劑對stat分鐘和cox-2結(jié)果的影響鞣花酸抑制5-8F細(xì)胞COX-2和stathmin的表達(dá),隨藥物濃度增加,COX-2和stathmin的表達(dá)抑制越明顯(圖3)。3免疫調(diào)節(jié)作用鞣花酸對多種腫瘤具有抑制作用,其機(jī)制有:1)鞣花酸與致癌劑的活性代謝物結(jié)合形成無害的化合物,阻止致癌劑與細(xì)胞DNA結(jié)合;2)鞣花酸抑制亞硝基化合物、多環(huán)芳香類化合物和黃曲霉素B1等物質(zhì)的代謝活性;3)鞣花酸誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫(GST),催化還原型的谷胱苷肽(GSH)的巰基結(jié)合到疏水的化合物上,使親電子化合物變成親水的物質(zhì),將體內(nèi)致癌物和斷裂劑產(chǎn)生親電子的潛在毒性物質(zhì)降解排出,抑制細(xì)胞癌變。Malik等報道:鞣花酸具有抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的生長,并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的作用。Li等用鞣花酸處理膀胱癌T24細(xì)胞株后,細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期,細(xì)胞生長明顯受到抑制。本實驗結(jié)果顯示:五倍子提取物鞣花酸對鼻咽癌細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,具有劑量依賴性,6μg/mL鞣花酸作用48h,5-8F細(xì)胞的抑制率高達(dá)61%,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻滯細(xì)胞于S期。COX-2是一種膜結(jié)合蛋白酶,是前列腺素合成的限速酶。在多數(shù)正常細(xì)胞中,COX-2不表達(dá)或低表達(dá),當(dāng)受生長因子、內(nèi)毒素及腫瘤促進(jìn)因子等作用時呈高表達(dá),參與炎癥、腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。COX-2在多種腫瘤組織中呈高表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞的凋亡。塞來昔布具有選擇性抑制COX-2表達(dá),塞來昔布體外與胃癌細(xì)胞株BGC-823孵育,癌細(xì)胞增殖抑制,凋亡增強(qiáng)。沉默胃癌細(xì)胞COX-2,細(xì)胞周期阻滯,細(xì)胞增殖明顯抑制。本研究中,鞣花酸處理鼻咽癌5-8F細(xì)胞48h后,COX-2的表達(dá)下調(diào),細(xì)胞增殖受抑制。Stathmin是細(xì)胞質(zhì)中普遍存在的微管調(diào)節(jié)磷蛋白,基因全長6.3kb,定位于人染色體1p35~36.1。Stathmin調(diào)控與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)的多個信號分子和多條信號途徑,在腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成等惡性表型的維持過程中起重要作用。抑制骨髓瘤細(xì)胞stathmin基因表達(dá),可使細(xì)胞增殖力下降,生長受到抑制,細(xì)胞呈典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示細(xì)胞周期阻滯于G2/M期,C3H小鼠移植瘤實驗顯示stathmin沉默的LM8骨髓瘤細(xì)胞致瘤能力降低,腫瘤生長減緩。沉默白血病K562細(xì)胞stathmin,細(xì)胞的增殖受到抑制?？箂tathmin單克隆抗體和紫杉醇單用或聯(lián)合使用,對HepG2細(xì)胞均具有