鎖陽多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其含量測定

鎖陽多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其含量測定

鎖陽，俗稱“老藥”，也被稱為羊咬不拉。這是鎖陽科多年生寄生草本植物的鎖陽。它通常生長在小麥科的白刺科上?，F(xiàn)代藥理學研究證明,鎖陽多糖具有延緩衰老、抗疲勞、提高機體免疫力、抗應激及抗糖尿病等作用。鎖陽的保健價值已被廣泛重視,出現(xiàn)了鎖陽咖啡、鎖陽糖、鎖陽沖劑等以鎖陽多糖為主要原料的食品、保健品、禮品及藥品等,具有很大的開發(fā)潛力。本實驗采用單因素及正交實驗法對超聲輔助提取鎖陽多糖的工藝進行優(yōu)化,并對不同來源鎖陽樣品中多糖含量進行測定,為鎖陽多糖的提取、含量測定以及質量標準的制定提供科學依據。1材料和方法1.1超純水的制備鎖陽瓜州億得生物科技有限公司提供,產地為甘肅省瓜州縣,經鑒定為鎖陽科鎖陽屬植物鎖陽(CynomoriumsongaricumRupr.)的肉質莖,樣品于50℃干燥恒重,粉碎,過100目篩,密封保存?zhèn)溆谩Ｆ咸烟翘旖蛑逻h;苯酚天津富宇;濃硫酸白銀銀環(huán);石油醚天津富宇等均為分析純;實驗用水為超純水由純水儀制得。KQ-600DE型數控超聲波清洗儀昆山市超聲儀器有限公司;AB104-N電子天平Mettle-Toledo公司;CARY50ProbeUV-VisiblespectrophotometerVARIANAustraliaRTYLTD;Exceed-Da-20型艾柯純水儀成都康寧實驗純水儀器廠。1.2實驗方法1.2.1樣品溶液中葡萄糖含量的測定1.2.1.提取與除蛋白質稱取干燥的鎖陽粉末100g,石油醚脫脂2次/1h,藥渣揮干溶劑后,80%乙醇回流提取2次/2h,藥渣揮干溶劑,加蒸餾水水浴回流提取3次/2h。過濾,合并3次提取液,濃縮至200mL左右,加0.1%活性炭,80℃水浴1h脫色,放冷后過濾。濾液中加95%乙醇,使含醇量達80%,靜置過夜,離心后將沉淀用蒸餾水溶解,按Sevag法(氯仿-正丁醇(4∶1))除蛋白質。再將水液反復醇沉3次,離心后取沉淀,以無水乙醇、丙酮、乙醚多次洗滌,干燥后即得鎖陽粗多糖。1.2.1.葡萄糖對照溶液精密稱取105℃干燥至恒重的標準葡萄糖25mg,置250mL容量瓶中,加蒸餾水溶解并定容至刻度,得0.1mg/mL的葡萄糖對照溶液。1.2.1.3.試溶液的制備精密稱取鎖陽粗多糖100mg,加水溶解并定容至50mL,得供試品溶液備用。1.2.1.%苯酚法精密吸取對照品溶液和供試品溶液各1.0mL于具塞試管中,加蒸餾水1.0mL。另取2.0mL蒸餾水作為空白。每一試管中加入1.0mL5%苯酚溶液,混勻,迅速加入5.0mL濃硫酸,搖勻,放置10min,置40℃水浴保溫15min,取出后迅速冷卻至室溫。于400~700nm波長范圍內進行掃描,結果表明葡萄糖對照品與鎖陽多糖在490nm處均有特征吸收,故選490nm作為測定波長。1.2.1.加蒸餾時間的確定精密移取葡萄糖對照液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,依次加蒸餾水使最終體積為2.0mL,另取2.0mL蒸餾水作為空白。同“測定波長的選擇”項下方法操作,于490nm處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標,葡萄糖濃度為橫坐標繪制曲線。1.2.1.鎖陽多糖得率的測定精密稱取鎖陽樣品粉末1.0000g,6倍體積石油醚回流脫脂2次/2h,藥渣揮干石油醚后,以6倍體積80%乙醇回流提取2次/2h。藥渣揮干溶劑后以蒸餾水為提取溶劑,按不同的超聲功率、料液比、提取溫度、超聲提取時間、提取次數制得鎖陽多糖提取液,冷卻后,加水定容于100mL容量瓶中,搖勻,得鎖陽供試品溶液。稀釋至合適濃度后吸取2.0mL于具塞試管中,按“標準曲線的繪制”項下操作,測定供試品溶液的吸光度值,并按下式計算多糖得率。式中:C為供試液中葡萄糖濃度(mg/mL);V為稀釋后供試液總體積(mL);m為供試品重量(mg)。1.2.2單因素研究選擇超聲功率、料液比、提取溫度、超聲提取時間及提取次數為因素,考察各因素對鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.超聲功率對鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,超聲功率分別設定為240、360、480、600W(不同超聲功率做3個平行),以料液比1∶30,提取溫度80℃,超聲時間70min,提取2次,考察超聲功率對鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.料液比對鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結果的基礎上,料液比分別設定為1∶6、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(不同料液比做3個平行),提取溫度80℃,提取時間70min,提取2次,考察料液比對鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.提取溫度對鎖陽多糖得率的影響試驗精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結果的基礎上,提取溫度分別設為60、70、80、90℃(不同溫度做3個平行),提取時間70min,提取2次,考察提取溫度對鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.超聲提取時間對鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結果的基礎上,提取時間分別設定為30、50、70、90min(不同時間做3個平行),提取2次,考察超聲提取時間對鎖陽多糖得率的影響。1.2.2.提取次數對鎖陽多糖得率的影響精密稱取鎖陽粉末1.0000g,在以上因素篩選結果的基礎上,提取次數分別設定為1、2、3、4次(不同提取次數做3個平行),考察提取次數對鎖陽多糖得率的影響。1.2.3鎖陽中多糖提取工藝的正交實驗綜合單因素實驗結果,設計4因素3水平(L9(34))正交實驗對鎖陽中多糖超聲提取工藝進行優(yōu)化,并利用SPSS軟件對實驗數據進行方差分析。實驗設計中的因素水平表見表1。1.2.4方法研究1.2.4.1.精細試驗精密吸取一定量對照品溶液,按“標準曲線的繪制”項下方法測定其吸光度,連續(xù)測定6次。1.2.4.2重復試驗1.2.4.對照品溶液和樣品溶液吸收劑用量的測定精密吸取在放置0、2、4、6、8h后的對照品溶液和樣品溶液各1.0mL置具塞試管中,按“標準曲線的繪制”項下操作,測定其吸光度。1.2.4.加樣回收率及rsd值的測定精密稱取9份同一批已知含量的鎖陽樣品,分別精密加入一定量的對照品,同時制取9份提取液,按“標準曲線的繪制”的方法測其吸光度值,計算回收率及RSD值。1.2.5鎖陽供試品溶液的制備精密稱取各批次鎖陽粉末1.0000g置于100mL圓底燒瓶中,按照最優(yōu)工藝,制得的鎖陽提取液,冷卻后,加水定容于100mL容量瓶中,搖勻,得鎖陽供試品溶液。稀釋至合適濃度后吸取2.0mL于具塞試管中,按“標準曲線的繪制”項下的操作,測定供試品溶液的吸光度,按得率公式計算樣品中多糖含量。2結果與分析2.1葡萄糖溶液線性范圍根據“標準曲線的繪制”項下方法,測得回歸曲線方程:Y=12.6308X-0.0144(r=0.9997),表明葡萄糖溶液在0.01~0.09mg/mL濃度范圍內,線性關系良好(實驗數據如圖1所示)。2.2單因素研究和結果2.2.1超聲功率對多糖得率的影響實驗結果如圖2所示,超聲功率從240W增大到480W時,多糖得率隨之增大,并在480W時達最大值,當超聲功率繼續(xù)增大,得率下降,故選擇超聲功率為480W。2.2.2不同時間點多糖得率實驗結果如圖3所示,料液比從1∶6增加到1∶30的過程中,多糖得率逐漸增大,至1∶30時達最大值。隨后繼續(xù)增大料液比,得率下降,故選擇提取料液比為1∶30。2.2.3提取溫度對多糖得率的影響實驗結果如圖4所示,溫度從60℃升高到80℃過程中,多糖得率隨提取溫度的升高逐漸增大,80℃時達最大值。而后隨溫度繼續(xù)增大,得率下降,故選定提取溫度為80℃。2.2.4超聲提取時間對多糖得率的影響實驗結果如圖5所示,超聲提取時間從30min增加至70min的過程中,多糖得率逐漸增大,且在70min時達最大值,而后減小,故選擇超聲提取時間為70min。2.2.5提取時間對得率的影響實驗結果如圖6所示,提取次數從1次到2次,得率增大幅度較明顯,再增加提取次數,得率沒有明顯的提高,故選定提取次數為2次。2.3鎖陽多糖得率正交實驗設計在單因素篩選結果基礎上,為進一步考察各因素之間的相互影響,選擇超聲功率(A)、料液比(B)、提取溫度(C)和超聲提取時間(D)為考察因素,以多糖得率為評價指標,設計了4因素3水平(L9(34))正交實驗。正交實驗結果見表2;方差分析結果見表3。正交實驗數據顯示,各因素對鎖陽多糖得率影響次序為:提取溫度>超聲功率>料液比>超聲時間。得到最佳條件為A1B3C2D1,即超聲功率為420W,料液比為1∶35,提取溫度為80℃,提取時間為60min。2.4最佳配方的驗證按正交實驗確定的最佳提取條件并在提取2次情況下,測得多糖含量為4.51%(n=5,RSD=1.98%),比正交實驗結果中的較優(yōu)組4.37%得率高,表明此正交實驗得出的最優(yōu)組合準確可行。2.5研究方法的結果2.5.1精密度實驗結果如表4所示,6次連續(xù)測定吸光度值的RSD=0.10%,表明儀器精密度良好,測定結果可靠。2.5.2重復實驗實驗結果如表5所示,多糖含量的相對標準偏差RSD=1.98%,表明本方法重復性良好。2.5.3穩(wěn)定實驗2.5.4相對標準偏差實驗結果如表7所示,加樣回收率在95.81%~104.20%之間,相對標準偏差RSD=3.03%(n=9),表明該方法簡便、快速、準確,靈敏度高,可用于鎖陽多糖的含量測定。2.6瓜州鎖陽多糖含量的變化根據正交實驗得出的最佳提取工藝,提取并測定不同來源的鎖陽樣品多糖含量,結果如表8:實驗結果顯示,瓜州鎖陽除2009年5月采摘的002號樣外,其余樣品的多糖含量明顯高于內蒙和新疆樣品,這可能與其當年的生長環(huán)境的土壤營養(yǎng)、水分、氣候等因素有關。瓜州鎖陽中,又以三九鎖陽多糖含量最高;不同生產年限鎖陽中,多糖含量也有一定的差異。3超聲提取鎖陽多糖的最佳條件近年來,使用超聲提取鎖陽多糖的研究較少,且均未對超聲功率進行篩選研究。本研究結果表明,超聲功率對鎖陽多糖得率影響顯著,并且得到的超聲提取工藝能明顯提高鎖陽多糖的得率。本研究通過單因素及正交實驗的系統(tǒng)篩選研究結果表明,各影響因素中,提取溫度和超聲功率對鎖陽總多糖得率影響顯著,而料液比和超聲時間的影響較小。得到超聲提取鎖陽多糖的最佳條件為:超聲功率為420W,料液比為1∶35,提取溫度為80℃,提取時間為60min。且通過精密度、重復性、穩(wěn)定性和加樣回收率實驗結果表明此方法操作簡便、靈敏度高,適合鎖陽樣品中多糖含量的測定。對不同來源鎖陽樣品中多糖含量測定結果表明,瓜州鎖陽樣品中多糖含量較新疆和內蒙兩地的高,而瓜州樣品中又以三九鎖陽多糖含量最高,這與“瓜州鎖陽甲天下”和