綿羊皮膚血管瘤中kap8-1基因表達(dá)量的測(cè)定

綿羊皮膚血管瘤中kap8-1基因表達(dá)量的測(cè)定

角蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)（角蛋白，kap）和角蛋白中間的絲狀角蠶絲是羊毛纖維的主要組成部分。羊毛和山羊的角蛋白組成和含量與纖維的質(zhì)量密切相關(guān)。Yu等(2009)研究發(fā)現(xiàn)不同綿羊品種的KAP的差異表達(dá)對(duì)羊毛品質(zhì)具有決定性的作用。Zhou等(2012)指出有超過(guò)上百種KAP基因被分為27個(gè)KAP家族,在哺乳動(dòng)物體內(nèi)相繼被鑒定。KAP分為含硫KAP、超高硫KAP、高甘氨酸/酪氨酸KAP3種類(lèi)型。Matsunaga等(2013)研究發(fā)現(xiàn),高甘氨酸/酪氨酸KAP有助于增加毛纖維機(jī)械強(qiáng)度和促進(jìn)毛發(fā)的形成。羊毛性狀在品種間、品種內(nèi)、不同品系間存在一定的差異,且普遍認(rèn)為受微效多基因控制的,也可能存在主效基因。趙志東等(2012)指出角蛋白基因的差異表達(dá)引起不同區(qū)域和不同品種絨山羊所產(chǎn)羊絨的品質(zhì)存在著明顯差異。因而本研究候選了編碼毛纖維的結(jié)構(gòu)蛋白KAP8-1基因作為研究對(duì)象,從而探索KAP8-1基因?qū)d羊皮膚毛囊發(fā)育的調(diào)控作用,為進(jìn)一步明確KAP8-1基因與羊毛品質(zhì)之間的關(guān)系提供參考。1基于生物活性的ro-pcr擴(kuò)增10月齡3個(gè)雜交組合羊:杜泊羊(♂)×小尾寒羊(♀)組(簡(jiǎn)稱DH組)、南非肉用美利奴羊(♂)×小尾寒羊(♀)組(簡(jiǎn)稱NH組)、南非肉用美利奴羊(♂)×東北細(xì)毛羊(♀)組(簡(jiǎn)稱ND組)各3只由乾安縣志華種羊場(chǎng)提供。取肩部皮膚,迅速放入液氮中保存,用于總RNA的提取。TrizolRNA提取液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;TaqDNA聚合酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。PCR儀(Eppendorf公司);核酸分析儀(BioRad公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)。按Trizol法提取總RNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量,用核酸分析儀檢測(cè)RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,合成反應(yīng)體系20μL:總RNA2μg,OligodTPrimer1μL,dNTPMixture1μL,5×First-strandBuffer4μL,TM-MuLVReverseTranscriptate1μL,RNaseInhibitor1μL,RNaseFreedH2O補(bǔ)齊至20μL?；靹蛑糜赑CR儀器中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,反應(yīng)條件:42℃50min,70℃10min。利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物,引物序列見(jiàn)表1。以cDNA為模板,擴(kuò)增目的基因片段,PCR反應(yīng)體系50μL:cDNA2μL,上、下游引物各2μL,2×TaqMasterMix25μL,RNaseFreeH2O19μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,26個(gè)循環(huán);72℃延伸2min。反應(yīng)結(jié)束后,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以純化的cDNA為模板,β-actin為內(nèi)參,采用Real-timePCRSYBRGreenⅠ染料法,對(duì)KAP8-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行定量分析。Real-timePCR反應(yīng)總體系20μL:SYBRGreenReal-timePCRMasterMix10μL,上、下游引物各0.8μL,模板cDNA2μL,RNaseFreedH2O6.4μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性1min;95℃變性50s,60℃退火15s,72℃延伸45s,40個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光定量Ct值,采用2-△△Ct法計(jì)算KAP8-1基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。2熒光定量rt-pcr檢測(cè)kap8-1和-actin基因的表達(dá)用核酸測(cè)定儀測(cè)得總RNA樣品D260nm/D280nm均為1.8~2.0之間;總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果顯示,28S、18S和5S條帶清晰(圖1),說(shuō)明總RNA的質(zhì)量較好。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板,對(duì)KAP8-1和β-actin基因分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)圖2、3。由圖2、3可知,KAP8-1和β-actin基因都擴(kuò)增出了目的片段,且擴(kuò)增特異性好,進(jìn)一步說(shuō)明提取的RNA質(zhì)量可以滿足熒光定量RT-PCR試驗(yàn)的要求。由圖4可知,熒光定量分析結(jié)果表明,KAP8-1基因mRNA在3個(gè)雜交種綿羊皮膚毛囊中均有表達(dá),而以細(xì)毛羊?yàn)槟副镜哪戏侨庥妹览?♂)×東北細(xì)毛羊(♀)組綿羊KAP8-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量高于另外2組,且三者相對(duì)表達(dá)量比值為7.56∶2.19∶1,說(shuō)明KAP8-1基因?qū)d羊皮膚毛囊的發(fā)育、羊毛品質(zhì)差異具有一定的調(diào)控作用。3最明顯的基因在前后抗氧化和結(jié)構(gòu)上的表達(dá)劉海英等(2010)采用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊群體中KAP8-1基因多態(tài)性檢測(cè),關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,不同基因型對(duì)產(chǎn)絨量、絨長(zhǎng)度和毛長(zhǎng)度有顯著影響(P<0.05),但對(duì)絨細(xì)度沒(méi)有影響。王志有等(2010)利用PCR-SSCP技術(shù)研究了高原型藏綿羊KAP8基因外顯子的多態(tài)性,結(jié)果表明,KAP8基因AB基因型的產(chǎn)毛量性狀顯著高于AA和BB基因型(P<0.05),KAP基因不僅在不同品種羊皮膚內(nèi)存在差異表達(dá),且相同品種的不同毛囊類(lèi)型內(nèi)也存在差異表達(dá)。汪玲(2010)利用原位雜交技術(shù)對(duì)遼寧新品系絨山羊興盛期KAP7.1和KAP8.2基因在初、次級(jí)毛囊中表達(dá)進(jìn)行定位,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,KAP7.1和KAP8.2基因在次級(jí)毛囊中表達(dá)均高于在初級(jí)毛囊中的表達(dá),相對(duì)定量分析發(fā)現(xiàn),KAP7.1在次級(jí)毛囊中的表達(dá)量是初級(jí)毛囊的2.28倍,而KAP8.2在次級(jí)毛囊中的表達(dá)量更高,是初級(jí)毛囊的2.71倍。邢孟欣(2010)通過(guò)Real-timePCR研究發(fā)現(xiàn)KAP8.1基因在遼寧新品系絨山羊初、次級(jí)毛囊中的表達(dá)量差異不明顯。此外,KAP8.1基因在初級(jí)毛囊中存在對(duì)稱和不對(duì)稱表達(dá),在毛球彎曲處有微弱的表達(dá),且在初級(jí)毛囊的髓質(zhì)層中表達(dá)。Yu等(2009)采用原位雜交技術(shù)研究了KAP基因在毛囊中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),KAP6-1基因在毛囊皮層細(xì)胞內(nèi)表達(dá),說(shuō)明其對(duì)毛囊內(nèi)特定結(jié)構(gòu)的形成具有一定的作用。王利等(2011)利用經(jīng)體外合成、用地高辛標(biāo)記的阿爾巴斯白絨山羊高甘氨酸/酪氨酸KAP基因家族成員的cRNA探針,通過(guò)原位雜交技術(shù)探測(cè)其基因家族成員在內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊皮膚毛囊中強(qiáng)烈的表達(dá)信號(hào),說(shuō)明高甘氨酸/酪氨酸KAP是絨山羊毛和絨皮質(zhì)蛋白的組成成分,是皮質(zhì)層中起角質(zhì)化作用的重要蛋白質(zhì),直接參與絨毛和粗毛的合成,對(duì)毛發(fā)的理化性質(zhì)具有重要作用。Gong等(2011)指出KAP基因的多態(tài)性與絨品質(zhì)顯著相關(guān)。艾買(mǎi)提·買(mǎi)買(mǎi)提(2013)研究發(fā)現(xiàn),KAP8-1與KAP8-2基因可分別作為中國(guó)美利奴羊(新疆型)毛細(xì)度評(píng)分、毛彎曲評(píng)分