TLC板技術(shù)經(jīng)驗交流

TLC薄層層析技術(shù)1.一、TLC簡介

二、操作過程三、擴展及用途四、問題討論主要內(nèi)容：2.背景：薄層色譜法(Thin-LayerChromatography,簡稱TLC〕是Kirchner等人在五十年代從經(jīng)典柱色譜法及紙色譜法的根底上開展起來的一種色譜技術(shù)。六十年代后，Stahl等人對薄層色譜法的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)格化及擴大應(yīng)用等方面進(jìn)行了許多工作，使該法日趨成熟。2021年版中國藥典一部有3341項鑒別采用TLC法分類：按薄層色譜使用的固定相的性質(zhì)及其別離機制可分為 吸附薄層、分配薄層、離子交換薄層及分子排阻薄層背景和分類3.原理:利用吸附劑(硅膠)對樣品中各組分吸附能力不同，及展開劑對它們的解吸附能力的不同，使各組分到達(dá)別離的目的。

特點：微量、快速、簡單、節(jié)省一般認(rèn)為TLC是一種定性和半定量的方法原理和特點4操作過程5氧化鋁有弱堿性pH=9、酸性pH=4及中性pH=7.5三種氧化鋁。弱 堿性氧化鋁用來別離中性或堿性化合物；中性氧化鋁適用于酸 性及對堿不穩(wěn)定的化合物的別離；酸性化合物可用酸性氧化 鋁別離。

硅藻土、纖維素、葡聚糖凝膠等化學(xué)鍵合固定相〔C18、C8等〕薄層板硅膠外表帶硅醇基〔－Si－OH〕，呈弱酸性(pH=4.5)，活性硅膠適合分 離酸性或中性化合物，如酚類、有機酸、醛類、甾體化合物以及 氨基酸類，是基于吸附作用；非活性硅膠含有一定的水，在別離 色素時是基于分配作用。6硅膠G:是含有13％煅石膏〔gypsum〕黏合劑的硅膠硅膠H：不含黏合劑的硅膠硅膠HF254：不含黏合劑，含有一種無機熒光劑〔如錳激活的 硅酸鋅〕，在254nm波長紫外光下呈強烈黃綠色熒光硅膠GF254：含有煅石膏黏合劑，含熒光劑，在254nm波長紫 外光下呈強烈黃綠色熒光硅膠HF254+366：不含粘合劑，在254與366nm波長有熒光硅膠PF254：制備型的，在254nm有熒光〔有熒光劑，適用于 不發(fā)光不易顯色物質(zhì)的制備與別離〕市售預(yù)制板規(guī)格7將吸附劑或載體均勻涂布在玻璃板、塑料片或鋁箔上的預(yù)制板。薄層有軟板及硬板兩種。硬板系在吸附劑中參加適量粘合劑后用濕法涂層，粘合劑的參加可以增加薄層的強度。常用的粘合劑為羧甲基纖維素鈉(CMCNa)或煅石膏(CaSO41/2H2O)使用前一般應(yīng)于110℃下活化30min

薄層厚度約為0.2-0.3mm。制備板0.5-2mm。薄層的制備8手動點樣：靈活方便，常用于各種TLC鑒別中。自動點樣重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性好，常用于薄層掃描法的含量測定。半自動點樣儀點樣量：原點位置的負(fù)荷有限，體積0.5～10微升， 濃度通常為0.5～2mg。直徑3mm以內(nèi)樣品溶劑：原那么上應(yīng)選擇對可以溶解但溶解度 不是很大的溶劑一定要有交叉點點樣Spyringe9Note:a.點樣的濃度要控制適當(dāng)；b.點的斑點較小，展開的TLC 別離度好c.0.3mm毛細(xì)點有機相， 0.5mm點水相。毛細(xì)管取樣1cm？3.14*〔0.3mm/2〕2*10mm=1.413mm3=0.71μL3.14*〔0.5mm/2〕2*10mm=3.925mm3=1.96μL10點樣常見問題1、點樣量太多。展開劑不能全部負(fù)載2、太濃了。展開劑從原點外圍繞行3、濃。未分開4、樣品溶劑殘留。吹干時應(yīng)注意高溫

破壞樣品5、點樣量太少?？床磺?、樣品溶劑中溶解度很大。原點將變

成空心圓11一般極性溶劑體系(CH2Cl2,THF,ethylacetate,etc)強極性溶劑體系(DMSO,DMF)需要淬滅的體系(NaH,LiAlH4,n-BuLi,etc)強堿、酸性物質(zhì)(NaOH,H2SO4,etc)一般不推薦直接取樣，建議淬滅后簡單后處理再取樣，或稀釋后取樣。最好簡單后處理（加水和有機溶劑萃?。┮院笕犹幚恚ㄈ缂铀蛩岷陀袡C溶劑）后取樣最好中和后取樣Note:

a.產(chǎn)品在水相or有機相；

b.有無沒溶解的固體。反響液的取樣：12展開方法展開劑浸入薄層下端高度不應(yīng)超過0.5cm，留神將樣品帶被展開劑浸泡硬板可以進(jìn)行近水平、上行、下行、雙向、屢次展開等展開槽有直立式、平臥式、雙槽式、夾心式或水平式13Note：a.展開槽應(yīng)密閉。溶劑蒸氣、液相(展開劑)、固定相(吸附劑)一起構(gòu)成復(fù)雜的三維層析過程b.展缸預(yù)先飽和以減弱邊緣效應(yīng)，如果薄層板也同時預(yù)飽和效果更佳。c.點樣帶寬時〔常見制備板〕。先用大極性溶劑展2cm以濃集樣品，枯燥薄層板，再用所需展開劑展開。14使各成分間有較好的別離;Rf在0.2～0.8為有效;監(jiān)控點應(yīng)在0.4~0.6之間不與待測組分發(fā)生化學(xué)反響;沸點適中，黏度較??；展開后組分斑點圓且集中；混合溶劑最好新鮮配制;展開劑的選擇原那么15展開方向有單向、單向長板、屢次、多種極性展開等.展一次展屢次第一次展開PE/EA=4:1

第二次展開CH2Cl2/MeOH=10:1采用屢次展開的方法可以提高TLC的別離效果。做一次檢測得到較多的樣品信息，展開前多思考。16展開機理的探討ABCD為硅膠層，EFCDG為展開劑，EF為展開劑前沿，CDG為展開劑水平面。展開劑以硅膠膠外表ED為界分ABCDEFG展開方向毛細(xì)層〔EFCD〕內(nèi)的展開劑理所當(dāng)然向AB方向運動依附層〔EDG〕的展開劑作為額外的補充源泉

同一瞬間，跨過薄層板上任一點展開劑的絕對量彼此相等，但由于液層厚度不同，必然存在速度差異所以，Rf值越大，斑點也就越大。17堿性物質(zhì)能與硅膠作用，易被吸附出現(xiàn)脫尾，加TEA，NH3H2O，Pyridine等防止先低后高，先單一后復(fù)雜，酸加酸，堿加堿，羰基加丙酮，相似相容原那么展開劑的選擇方法石油醚<二氯甲烷<乙醚<四氫呋喃<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水常用展開劑極性順序

18三角形法〔a〕適于吸附薄層;(b)適于分配薄層.〔a〕19.苯點滴實驗法最適宜的展開劑？20.Note：a.展開劑渾濁不清，應(yīng)分液澄清后b.正丁醇和丙醇對斑點擴散影響較小c.丙酮可混溶溶劑，降低劑粘度，加快展速d.由于混溶性和硅膠耐酸能力的限制，水和酸的使

用是有限度的。大展開劑:ArOH(aqsat.)、n-BuOH(aqsat.)、nBuOH-AcOH-H2O(5:1:1)、iPrOH-NH4OH-H2O(10:5:1)常用展開劑對：E/P、M/D、PE/Acetone、THF/PE、 MeOH/Toluene、DCM/PE21nBuOH/acetone/AcOH/H2OVB1及其磷酸酯nPrOH/NH3H2O(con.)/H2O=20/20/1AMP單磷酸及3,5-雙磷酸n-BOH/HOAc/H2O=5/1/1巰基乙胺及甲基化后22DCM/MeOH/HOAc=10/1/0.05甘氨膽酸THF/PE=2/3ED-71中間體AsMg、FPM中間體硫醚，亞砜、砜23顯色一看、首先在日光下觀察，劃出有色物質(zhì)的斑點位置二照、在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點三碘、多數(shù)有機物吸附碘可逆的產(chǎn)生棕色或黃色斑點四顯、既無色又無紫外吸收的物質(zhì)，可以用顯色劑顯色DIEAPE/EA=1:2NEt324各種常用顯色劑及其配制方法:硫酸溶液

硫酸-水(1：1)溶液；硫酸-甲醇或乙醇(1：1)溶液；1.5mol／L硫酸溶液與0.5-1.5mol／L硫酸銨溶液大部分化合物高錳酸鉀

1.5gKMnO4+10gK2CO3+1.25mL10%NaOH+200mL含還原性基團化合物，比如羥基，氨基，醛磷鉬酸(PMA)

乙醇5％磷鉬酸乙醇溶液噴后120℃（可用加熱槍）緩慢烘烤還原性化合物顯藍(lán)色，再用氨氣薰，則背景變?yōu)闊o色。茚三酮O.2g溶于乙醇l00ml中。方法：噴后于110oC加熱。醋酸呈紅紫色斑點氨基酸或胺基

溴甲酚綠溴甲酚綠0.1g溶于乙醇500ml和0.1mol/L氫氧化鈉溶液5ml酸或堿

25續(xù)表茴香醛溶液674mL乙醇+18.5mL茴香醛+25mL濃硫酸浸泡后吹干再加熱氰基、胺基及硝基2,4-二硝基苯肼2g2,4-二硝基苯肼+60mL濃硫酸+80mL水+200mL乙醇酮一般顯黃色，飽和醛則顯紅色或磚紅色不定羰基的化合物吲哚醌1g溶于100ml丙酮中，加入10ml醋酸。噴灑試劑后，100～110℃加熱l0min，顯藍(lán)、紅、桃紅或棕色斑點氨基酸、多肽香草醛/硫酸香草醛1g溶于硫酸lOOml。噴后于120℃加熱至呈色最深。高級醇、酚、甾類及精油26定性影響Rf值的因素較多：溫度、濕度。一般在較高溫度下展開時，Rf值較高，反之降低需經(jīng)過兩種以上不同組成的展開劑得到的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)品一致時，才可認(rèn)定該斑點與標(biāo)準(zhǔn)品是同一化合物；通過斑點顏色，有無紫外吸收或產(chǎn)生螢光的顏色，以及用專屬性顯色劑后斑點顯色的情況與標(biāo)準(zhǔn)品對照可幫助鑒定27手性薄層色譜一、手性選擇劑混合制板〔較難實現(xiàn)〕二、手性選擇劑添至流動相中，作展開劑使用三、？好的分析方法應(yīng)該是簡單的，簡潔是一種美。28手性薄層色譜別離的因素手性選擇劑的種類、純度、濃度大小、與吸附劑的比例化合物消旋化，配置成溶液后這種趨勢變得更大。29Nature1965208,p71-72nBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomernBuOH/Pyridine/H2O=1/1/1L-isomerD-isomer30純度?狀態(tài)?合理?可行?TLC用途31.監(jiān)測反響進(jìn)程:反響有無新點產(chǎn)生原料有無剩余，剩余多少反響是否干凈綜合判斷反響如何處理Note：點樣量b.檢測時間c.留樣對照d.重要板留存32.反響物加完應(yīng)立即檢測；反響中出現(xiàn)變化〔溫度，顏色，氣體、沉淀〕立即檢測反響物加完后半小時內(nèi)應(yīng)檢測，然后適時跟蹤檢測快速反響的體系〔如硝化、復(fù)原〕，在短時間內(nèi)需要檢測過夜反響，過夜前后應(yīng)檢測檢測時機33.極性增大:NO2NH2RNH-Bn(Boc,Cbz)RNH2X-NH、CNR-S-R’R-SO-R’CHO〔R-X〕CH2OHCO2H官能團轉(zhuǎn)化極性大極性小極性相近的：

R=RR-R CHOC=C極性減小:OHX(Cl,Br,I)

COOHCO2R,R-SO-R’

R-SO2-R’-NH2(-OH)NH-R,(OH-R,)34TLC組合判斷TLC-HPLC/LC-Ms聯(lián)用〔定性和定量〕TLC-MS聯(lián)用(適用于拿標(biāo)樣點〕TLC-NMR聯(lián)用〔確認(rèn)結(jié)構(gòu)〕TLCMSNMRLCMs/HPLC35.后處理情況EAH2O固體的純度和母液的取舍SolidMothersolution萃取是否有效36.摸索柱層析洗脫條件Note:Rf值在0.2左右的展開劑比例為洗脫劑的適宜值過柱時組分流出順序未必和TLC上點極性順序一致Desiredproduct37.梯度洗脫38.制備TLC展開刮板洗脫點板顯色39.制備TLCNote:1溶劑:極性小,溶解性好，易揮發(fā)

2上樣量:40-60mg