小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病生防菌株分離及盆栽防治效果

小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病生防菌株分離及盆栽防治效果

小麥草仁菌?。╟cn）是一種全球土壤疾病，可危害小麥、大麥、麥冬、黑麥等谷物和飼料。自1989年在湖北首次報(bào)道以來(lái),該病害已廣泛分布于我國(guó)湖北、河南、河北、山東、山西、陜西、甘肅、內(nèi)蒙、青海、安徽、北京等10多個(gè)省市自治區(qū),以黃淮麥區(qū)發(fā)病最重。2007—2008年在我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)河南省進(jìn)行小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病普查,發(fā)現(xiàn)鄭州、安陽(yáng)、許昌等15個(gè)地市均有不同程度發(fā)生,發(fā)病面積達(dá)120萬(wàn)hm2,其中重病田面積在10萬(wàn)hm2以上。王振躍等報(bào)道,該病一般減產(chǎn)20%~30%,有些地塊甚至高達(dá)50%以上,并有不斷蔓延之勢(shì)。針對(duì)小麥孢囊線蟲(chóng)的防治方法國(guó)內(nèi)外已做了一些研究,并摸索出了一些有效的防控措施。澳大利亞通過(guò)培育和種植抗病小麥品種,已經(jīng)有效地控制了孢囊線蟲(chóng)病的危害;Brown研究表明,輪作和適當(dāng)調(diào)整播期可有效控制該病害。吳緒金等研究發(fā)現(xiàn),涕滅威、滅線磷等殺線劑具有一定的防治效果。但是,國(guó)內(nèi)大面積種植的小麥品種多數(shù)表現(xiàn)感病,輪作等農(nóng)業(yè)措施在我國(guó)廣大麥區(qū)難以實(shí)施,且化學(xué)殺線劑毒性大、成本較高,因此,尚缺乏有效的防治手段。國(guó)內(nèi)外已有許多植物線蟲(chóng)病害生物防治方面的研究,并篩選出大量的生防微生物,如細(xì)菌、真菌(捕食性真菌、線蟲(chóng)內(nèi)寄生真菌、卵寄生真菌、產(chǎn)毒真菌、菌根真菌等)、放線菌、原生動(dòng)物、捕食性線蟲(chóng)、殺線植物等,有些生防微生物如淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus、厚垣輪枝孢菌Verticilliumchlamydosporium已經(jīng)開(kāi)發(fā)出相應(yīng)產(chǎn)品并在生產(chǎn)上推廣使用,但有關(guān)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病生物防治則鮮有報(bào)道,為此,本試驗(yàn)對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)生防真菌進(jìn)行了篩選和鑒定。1材料和方法1.1孢囊分離方法病田土樣采自河南省鄭州市郊區(qū)、滎陽(yáng)市、安陽(yáng)縣、許昌縣等地小麥孢囊線蟲(chóng)病發(fā)生比較嚴(yán)重的地塊,采用土鉆多點(diǎn)取樣。取土?xí)r將表層干土去除,取0~20cm層的土壤,將土樣裝入封口塑料袋,帶回實(shí)驗(yàn)室備用。將取來(lái)的樣品在室內(nèi)風(fēng)干2~3周,先用直徑3mm的篩子除去較大土塊和殘根,然后采用Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法分離孢囊。預(yù)先將漂浮器和篩子淋濕,漂浮筒內(nèi)灌滿清水,將風(fēng)干土樣放入頂篩中,用水流沖洗,使土壤全部淋洗到漂浮筒內(nèi),并從環(huán)頸水槽流到60目篩子中。挑取篩子上的孢囊放入培養(yǎng)皿中備用。1.2菌落篩選、培養(yǎng)將孢囊用無(wú)菌水沖洗3次,放在潔凈培養(yǎng)皿里。在體視鏡下將孢囊刺破,然后移入馬丁氏培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)孢囊上長(zhǎng)出菌落后,挑取少許菌落邊緣的菌絲移入PDA平板上培養(yǎng)。采用單孢分離法進(jìn)行純化,并將純化的真菌菌株移入PDA斜面并編號(hào),在25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天后移到4℃冰箱中保存。1.3小麥孢囊線蟲(chóng)孵化和接種生防菌擴(kuò)繁:將分離到的真菌菌株接種到經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理的麥粒砂培養(yǎng)基中,在25℃條件下培養(yǎng)15天備用。小麥播種及生防菌接種:供試小麥品種為感病品種溫麥19,種子由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院小麥研究所提供。從沒(méi)有發(fā)生過(guò)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病的砂壤土田塊中采集土壤,過(guò)篩后160℃烘箱處理2h。每缽(約300g)加入5g培養(yǎng)好的生防真菌麥粒砂培養(yǎng)物,將培養(yǎng)物與經(jīng)過(guò)滅菌處理的無(wú)病土混合均勻,裝入培養(yǎng)缽并輕輕壓實(shí),并設(shè)不接種處理作為對(duì)照。每處理6次重復(fù)。將催芽的小麥種子放入上述培養(yǎng)缽中,每缽種5粒種子,然后覆蓋1~2cm過(guò)篩滅菌土,放入鋁托盤(pán)中,盤(pán)中澆透水后放在15~20℃人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。線蟲(chóng)孵化和接種:先用低溫刺激法孵化小麥孢囊線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)(J2)。方法:①將收集的孢囊放于離心管中,在4℃的冰箱中低溫處理30天,再放于15℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30天以孵化幼蟲(chóng);②用組織破碎器芯在離心管中輕輕扭動(dòng)1~2次后加入5~10mL無(wú)菌水,用三角瓶收集破碎孢囊及J2幼蟲(chóng)懸浮液;③將懸浮液倒入200目篩子中,用無(wú)菌水輕輕洗下200目篩子上的J2幼蟲(chóng),用三角瓶收集J2幼蟲(chóng);④定容至50mL,搖勻后取1mL滴入計(jì)數(shù)皿,在解剖鏡下計(jì)數(shù),確定線蟲(chóng)濃度。出苗7天后開(kāi)始接種J2線蟲(chóng),先用玻璃棒在營(yíng)養(yǎng)缽中小麥幼苗根部附近插入3~6cm深小洞,同時(shí)將已制備好的J2幼蟲(chóng)懸浮液200條/株用移液槍注入小洞內(nèi),再用細(xì)土封口。每隔3天接種1次,共接種3次,每株共接種600條幼蟲(chóng)。病情調(diào)查:接種60天后,調(diào)查小麥根部根結(jié)形成情況。將植株連根挖出,并盡可能保持根系完整。將取出的植株根系用自來(lái)水沖洗干凈,放在盛有清水的塑料盤(pán)中進(jìn)行病情調(diào)查,計(jì)算防治效果。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):0級(jí):根部無(wú)根結(jié);1級(jí):每株根部有1~5個(gè)根結(jié);2級(jí):每株根部有6~10個(gè)根結(jié);3級(jí):大部分根上有根結(jié),單株10個(gè)根結(jié)以上;4級(jí):根結(jié)相連成須根團(tuán),難以計(jì)數(shù)。1.4田間取樣方法根據(jù)室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果,選取F37、F15、F33等11個(gè)對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)初篩防控效果較好的菌株,在許昌縣小麥孢囊線蟲(chóng)病發(fā)生嚴(yán)重地塊進(jìn)行大田防治效果測(cè)定。供試生防菌株采用麥粒砂培養(yǎng)基擴(kuò)繁后以每米行長(zhǎng)施入5g的劑量進(jìn)行溝施,即取適量細(xì)干土與揉碎的生防菌培養(yǎng)物混合,撒施于播種溝內(nèi),與周?chē)寥阑靹蚝笤龠M(jìn)行播種。另設(shè)不處理的小區(qū)作為空白對(duì)照。分別在苗期和灌漿期調(diào)查小麥根部根結(jié)和孢囊形成情況,計(jì)算病情指數(shù)和防治效果。田間取樣方法采取隨機(jī)3點(diǎn)取樣,每樣點(diǎn)取20株,用小鐵鏟連同植株根系土壤挖出,帶回室內(nèi)調(diào)查。苗期調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法同1.3。小麥灌漿期病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法參照吳緒金等。即0級(jí):根部無(wú)孢囊,無(wú)病;1級(jí):感染極輕微,1~5個(gè)孢囊/株;2級(jí):輕度發(fā)生,6~20個(gè)孢囊/株;3級(jí):中度發(fā)生,20~40個(gè)孢囊/株;4級(jí):嚴(yán)重發(fā)生,單株孢囊在40個(gè)以上。病情指數(shù)=[(∑各級(jí)發(fā)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)別代表值)]×100;防治效果(%)=[(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100。不同分離菌株的防治效果采用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。1.5生殖器菌的形態(tài)和鑒定1.5.1形態(tài)特征觀察分別挑取待測(cè)真菌菌絲于PDA培養(yǎng)基上,在25℃條件下培養(yǎng)7天后,肉眼觀察菌株生長(zhǎng)速度、菌落顏色及表面特征等,測(cè)量菌落大小,用番紅染色后在顯微鏡下進(jìn)行菌絲、孢子形態(tài)觀察,記載菌株的形態(tài)特征。參照魏景超、Booth、孔華忠等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。1.5.2dna的pcr擴(kuò)增分別稱取50~100mg待鑒定菌株的菌絲體,加液氮充分研磨后,迅速轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中,用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的通用DNA純化試劑盒提取菌株基因組DNA,并利用該公司合成的通用引物ITS1:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′和ITS4:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化后,將DNA片段連接到pMD19,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選。將白色克隆挑入LB培養(yǎng)液中,菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序,采用DNAman軟件進(jìn)行序列分析,并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上通過(guò)BLAST比對(duì)分析。2結(jié)果與分析2.1對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病的防治效果結(jié)果表明,42個(gè)菌株中以F37和F15防治效果最好,均為64.7%,F33、F04、F26、F08、F03、F13、F11、F20和F25等9個(gè)菌株對(duì)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病的防治效果均達(dá)到50%以上,顯示出較好的生防潛力;F19、F22、F16和F41等4個(gè)菌株達(dá)到45%以上。以上15個(gè)菌株處理后病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照。F24、F28等18個(gè)菌株雖然也有一定的防治效果,但病情指數(shù)與對(duì)照差異不顯著。而F12、F35等8個(gè)菌株處理后病情指數(shù)甚至高于對(duì)照,說(shuō)明無(wú)防治效果(表1)。2.2對(duì)病害的防治效果結(jié)果顯示,各菌株大田苗期防治效果普遍較低,11個(gè)供試菌株雖病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照,但對(duì)病害的防治效果均低于40%,且各菌株之間差別不大。灌漿期調(diào)查發(fā)現(xiàn),F26、F04、F20和F08等4個(gè)菌株田間防治效果大于40%,F37菌株防治效果也在35%以上,這5個(gè)菌株處理病情指數(shù)均與對(duì)照差異顯著,而其它供試菌株防治效果均低于30%(表2)。2.3生殖器菌的鑒定2.3.1菌株鑒定及初步鑒定F20菌株:在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7天后,菌落直徑為35~60mm,暗綠色或灰綠色,質(zhì)地絨狀;分生孢子大量產(chǎn)生,易分散;菌絲體白色或近于白色;分生孢子橢圓形或長(zhǎng)橢圓形,壁光滑;分生孢子梗帚狀,帚狀枝通常雙輪生,偶有三輪生或單輪生,?；枯?~3個(gè),彼此通常較緊貼;瓶頸每輪5~8個(gè)或更多(圖1)。初步鑒定為半知菌青霉屬的草酸青霉Penicilliumoxalicum。F37菌株:在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7天,菌落直徑為70mm,菌落正面紫紅色,氣生菌絲較發(fā)達(dá),呈密絨狀或絮狀,產(chǎn)生紫紅或紫黑色色素,隨菌齡的增加而變深;小型分生孢子鏈狀著生在分枝的分生孢子梗上,卵圓形、橢圓形或腎形,單細(xì)胞,大型分生孢子少見(jiàn),未見(jiàn)厚垣孢子(圖2)。初步鑒定為半知菌類(lèi)鐮刀菌屬Fusarium的一種真菌。F04菌株:在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7天后,菌落直徑70mm,菌落正面白色,生長(zhǎng)均勻,背面初期白色,后期變淺黃色;菌絲致密平鋪,成地毯狀。長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)后基質(zhì)產(chǎn)生淡黃色斑塊。由于不產(chǎn)孢,無(wú)法進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。F08菌株:在PDA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7天,菌落直徑80mm,菌落白色,卷毛狀,邊緣平鋪,均勻生長(zhǎng),背面白色至淡黃色;分生孢子梗粗短,無(wú)色,光滑;產(chǎn)孢細(xì)胞瓶梗狀,無(wú)色,光滑;大型分生孢子呈鐮刀形或紡綞形,無(wú)色,光滑,兩頭漸細(xì),有的頂端喙?fàn)?足細(xì)胞明顯,1~4隔;小型分生孢子數(shù)量少,呈圓形或腎形,大多數(shù)單細(xì)胞,少數(shù)1個(gè)分隔,無(wú)色;厚垣孢子形成于菌絲及分生孢子中,球形,單生或成串(圖3)。初步鑒定為半知菌鐮刀菌屬的茄病鐮刀菌Fusariumsolani。F26菌株:在PDA培養(yǎng)基上25℃條件下培養(yǎng)7天后呈淡褐色或褐色,絨毛狀,菌落直徑50~70mm,背面黑褐色,菌絲體大量表生,少數(shù)埋生,菌絲淡褐色至中褐色,光滑,有分隔,單生或有分枝;分生孢子梗直立或略彎曲,側(cè)生于菌絲上或直接著生于菌絲頂端,產(chǎn)孢處形成膨大的囊狀體,分生孢子單生,長(zhǎng)方形或?qū)挋E圓形,淡褐色至中褐色,具1~3個(gè)橫隔膜,1~4個(gè)縱隔膜,大部分縱隔膜連續(xù)貫穿于橫隔膜之間,在橫隔膜處有輕微的縊縮現(xiàn)象(圖4)。初步鑒定為半知菌匍柄霉屬Stemphylium的一種真菌。2.3.2-內(nèi)酰胺酶菌株的篩選和序列分析分別測(cè)定了F04、F08、F20、F26和F37等5個(gè)菌株的ITS序列,并登錄GenBank,登錄號(hào)分別為GU055594.1、EU733633.1、FJ977097.1、EU807938.1和EF589878.1。經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,5個(gè)菌株相似性最高的屬種分別為毛殼菌Chaetomiumsp.、茄病鐮刀菌F.solani、草酸青霉P.oxalicum、茄匍柄霉Stemphyliumsolani和層出鐮刀菌Fusariumproliferatum,序列相似度分別達(dá)到99.61%、99.82%、99.83%、100.00%和99.47%。除了F04菌株因人工培養(yǎng)難以產(chǎn)孢無(wú)法進(jìn)行形態(tài)鑒定并與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果比對(duì)外,其它菌株形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法鑒定結(jié)果均一致。3對(duì)當(dāng)?shù)赝寥牢廴镜倪m應(yīng)小麥禾谷孢囊線蟲(chóng)病已經(jīng)成為我國(guó)黃淮麥區(qū)重要土傳病害,在目前缺乏有效防治措施的情況下,探索新的防治方法十分必要。本試驗(yàn)結(jié)果表明,多數(shù)生防菌株室內(nèi)防治效果與田間防治效果基本一致,但也有一些菌株室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果與大田試驗(yàn)不盡一致,如F15菌株在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中防治效果達(dá)到60%以上,而在大田試驗(yàn)中灌漿期防效只有6.47%,這可能與該菌株在自然土壤中定殖能力較差有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn),一些生防菌株在無(wú)菌土中可以很好地定殖和生長(zhǎng),但在自然土壤中由于多種土壤微生物的相互競(jìng)爭(zhēng)或?qū)ν寥览砘h(huán)境適應(yīng)性較差,難以大量定殖。本試驗(yàn)中F37、F20和F04等菌株的防治效果比較穩(wěn)定,其作用機(jī)制和利用途徑還有待深入研究。匍柄霉屬和毛殼菌屬真菌可防治一些真菌病害,草酸青霉P.oxalicum和茄病鐮刀菌F.solani可寄生于其它植物線蟲(chóng),林