鏈脲佐菌素誘導(dǎo)sd大鼠1型糖尿病模型的制備及穩(wěn)定性研究

鏈脲佐菌素誘導(dǎo)sd大鼠1型糖尿病模型的制備及穩(wěn)定性研究

糖尿?。╩）是一種代謝性臨床綜合征。第17條o、國際糖尿病協(xié)會(huì)表示，世界上有1.5億人，預(yù)計(jì)2025年會(huì)增加3億人。在發(fā)達(dá)國家DM患病率已達(dá)3%~7%,成為僅次于癌癥、艾滋病、心血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病,已成為世界第5位死亡主因。全社會(huì)在糖尿病的研究上投入了巨大的人力和財(cái)力。因此,建立穩(wěn)定可靠的糖尿病動(dòng)物模型成為該疾病研究的前提。目前建立糖尿病動(dòng)物模型方法較多,如切除胰腺、鏈脲佐菌素(STZ)和四氧嘧啶化學(xué)試劑誘發(fā)、病毒誘導(dǎo)、自發(fā)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型等,其中以注射STZ建立動(dòng)物模型的方法應(yīng)用最多,且方便實(shí)用,但關(guān)于給藥方式、注射的劑量、飼養(yǎng)環(huán)境等各家報(bào)道差異較大。為了進(jìn)一步研究的需要,本試驗(yàn)對(duì)制備SD大鼠1型糖尿病模型條件進(jìn)行了摸索,成功制備了SD大鼠1型糖尿病模型。1動(dòng)物分組、模型建立與指標(biāo)檢測(cè)1.1材料SD雄性大鼠,由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)前測(cè)每只大鼠的血糖值范圍在3.0~5.0mmol/L之間,為正常血糖值,所有大鼠實(shí)驗(yàn)前后均在相同環(huán)境下飼養(yǎng);微量血糖測(cè)定儀,美國強(qiáng)生(配套血糖試紙);STZ購于Sigma公司。1.2方法1.2.1STZ液配制:臨用前將STZ溶解于4℃冰箱預(yù)冷的0.1mol/L枸櫞酸三鈉-枸櫞酸緩沖液中(pH4.2),制成濃度為20mg/ml的STZ液。1.2.2實(shí)驗(yàn)分組1.2.2.1將體重為200~240g的SD大鼠24只按禁食與否分為2組,每組12只。一組正常飲食,另一組禁食12h,參照文獻(xiàn)STZ成模使用量一般為40~65mg/kg,該兩組均先給予STZ60mg/kg腹腔注射。1.2.2.2將SD大鼠48只按體重大小分為4組,每組12只。A組體重為160~200g;B組體重為201~240g;C組體重為241~280g;D組體重為281~320g。禁食12h后,給予STZ60mg/kg腹腔注射,篩選出成模率高的體重范圍。1.2.2.3將體重為200~240g的SD大鼠36只按給藥劑量不同分為3組,每組12只。禁食12h后,各組均分別按以下劑量一次性腹腔注射給藥:A組40mg/kg;B組50mg/kg;C組60mg/kg。1.2.2.4將體重為200~240g的SD大鼠24只按注射途徑不同分為2組,每組12只。禁食12h后,一組腹腔按50mg/kg注射給藥,另一組尾靜脈按50mg/kg注射給藥。1.2.3成模標(biāo)準(zhǔn):采用血糖儀測(cè)給藥后72h大鼠尾靜脈血糖值,以血糖≥16.7mmol/L作為糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。1.2.4成模穩(wěn)定性觀察:體重為200~240g的SD大鼠,按50mg/kg腹腔注射STZ成模后作為試驗(yàn)組,共14只,另取體重為200~240g的SD大鼠14只腹腔注射等量的枸櫞酸三鈉-枸櫞酸緩沖液作為對(duì)照組。兩組均用代謝籠單只喂養(yǎng),分別于注射后3,7,14,21d和28d對(duì)兩組動(dòng)物的血糖進(jìn)行測(cè)定,并對(duì)兩組動(dòng)物的每日采食量、飲水量和排尿量進(jìn)行比較分析。1.3統(tǒng)計(jì)分析使用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,率的比較采用χ2檢驗(yàn),當(dāng)理論頻數(shù)小于5時(shí),以fisher's確切概率法計(jì)算統(tǒng)計(jì)量;定量資料數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,試驗(yàn)組與對(duì)照組比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1sd大鼠成模率禁食組12只SD大鼠腹腔注射60mg/kgSTZ,有8只大鼠成模,其成模率為66.6%,而未禁食者12只SD大鼠僅4只成模(33.3%),雖成模率低于禁食組,但兩組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。2.2體重和體重對(duì)大鼠成模率的影響在采用空腹腹腔注射60mg/kgSTZ的條件下,大鼠體重可直接影響成模率,雖各體重組大鼠間成模率之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但體重小于200g或體重大于240g,其成模率呈下降趨勢(shì),體重201~240g組的大鼠成模率最高;160~200g組死亡率最高,281~320g組雖成模率低,但死亡率最低,見表1。2.3注射后gmfdm結(jié)構(gòu)模率分布體重均為200~240g的三組SD大鼠以不同劑量注射后,40mg/kg劑量組成模率最低,50mg/kg及60mg/kg劑量組成模率明顯升高,以50mg/kg組最高(83.3%),見表2。2.4尾靜脈組成模兩組體重為200~240g的SD大鼠按注射途徑不同制模,注射劑量均為50mg/kg,結(jié)果尾靜脈注射組成模率為91.7%(11/12),要高于腹腔注射組(83.3%),但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.5大鼠血糖值造模成功大鼠的血糖濃度明顯高于對(duì)照組,差異顯著且穩(wěn)定在≥16.7mmol/L的水平,結(jié)果見表3。2.6模型中的動(dòng)物飼料、飲用水和排尿量的組成功的大鼠日采食量、飲水量及排尿量比對(duì)照組有顯著性增加,存在明顯差異,見表4。3stz在實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性結(jié)果STZ為一種廣譜抗菌素,具有抗菌、抗腫瘤的性能和致糖尿病的副作用,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的胰島β細(xì)胞具有高度選擇性的毒性作用。一次性大劑量STZ注射導(dǎo)致速發(fā)型糖尿病模型,具有制造方法簡便、用藥量小、藥物毒性較低、胰島β細(xì)胞損傷特異性高等優(yōu)點(diǎn),已成為研究1型糖尿病及其并發(fā)癥的主要實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。其致糖尿病機(jī)制目前認(rèn)為是STZ引起特殊位點(diǎn)烷基化,進(jìn)一步導(dǎo)致多聚ADP-核糖體激活,胞內(nèi)NAD+和ATP耗竭,最終導(dǎo)致大量反應(yīng)性氧簇產(chǎn)生,建立理想的糖尿病動(dòng)物模型是研究糖尿病發(fā)病機(jī)理重要的一步。STZ的純品為結(jié)晶粉狀物,其溶液制劑不穩(wěn)定,故在配制之前,先將枸櫞酸三鈉-枸櫞酸緩沖液先置冰箱預(yù)冷后在臨用前再配制,配制好后立即使用,保證了STZ的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)中空腹腹腔給藥SD大鼠成模率要高于未禁食組,但兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異,但在后面的實(shí)驗(yàn)中仍將大鼠禁食12h,以保證更高的成模率。實(shí)驗(yàn)過程中我們發(fā)現(xiàn)大鼠體重對(duì)成模率也有一定的影響,體重小于200g的大鼠隨著體重的下降,成模率下降;體重大于240g的大鼠隨著體重的增加,成模率也逐漸下降,最佳成模體重為201~240g。得到最佳體重后,在禁食的基礎(chǔ)上,我們對(duì)STZ使用劑量進(jìn)行了摸索,文獻(xiàn)報(bào)道STZ一次腹腔注射致糖尿病的劑量為40~65mg/kg。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中,50mg/kg及60mg/kg的腹腔注射量成模率均高于40mg/kg劑量,但給藥劑量為60mg/kg時(shí),其成模率不及50mg/kg量,且死亡率增高,故本次實(shí)驗(yàn)中最佳腹腔注射劑量為50mg/kg。此外通過尾靜脈注射的大鼠成模率最高,其機(jī)制可能與靜脈注射部位準(zhǔn)確,藥物吸收更直接有關(guān),但由于大鼠尾靜脈較細(xì),尾靜脈注射需要一定的注射技術(shù),若注射不準(zhǔn)易造成藥物的溢出,加之操作時(shí)間過長也易造成STZ的性狀不穩(wěn)定且尾靜脈注射與腹腔注射成模率統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不明顯,故我們?nèi)赃x擇腹腔注射給藥來制造糖尿病大鼠模型。本試驗(yàn)利用50mg/kgSTZ對(duì)體重約201~240g且禁食后的大鼠一次