北京市售酸奶中添加的益生菌及細(xì)菌分離株對抗生素耐藥性檢測

北京市售酸奶中添加的益生菌及細(xì)菌分離株對抗生素耐藥性檢測

生物技術(shù)的發(fā)展促進了新食品的快速開發(fā)。隨著產(chǎn)品種類的增多，可以使用的抗生素種類日益增多。1989年美國食品和藥品管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)以及美國飼料監(jiān)察協(xié)會(AmericanAssociationofFeedControlOfficials,AAFCO)公布了41種可用于飼料的安全菌株。2002年,國際乳業(yè)聯(lián)合會公布了在食品中有長期使用歷史的18個屬81種細(xì)菌、2個屬11種絲狀真菌、8個屬21種酵母的微生物名單,其中乳酸桿菌有36個種、雙歧桿菌有8個種。我國于1996年公布了6種可用于動物微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的菌株,其中包括乳酸桿菌和雙歧桿菌。一些新分離、擬用于食品生產(chǎn)的益生菌菌種也在不斷申報之中。近年來,抗生素濫用導(dǎo)致益生菌產(chǎn)生耐藥性已引起全世界的廣泛關(guān)注。據(jù)報道,生產(chǎn)酸奶用的乳酸桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的某些菌株攜帶耐藥基因,這些益生菌進入人體后,通過介導(dǎo),可將耐藥基因傳遞給體內(nèi)的其他細(xì)菌,其中包括致病菌和非致病菌,導(dǎo)致機體對某種抗生素的普遍耐藥。HUMMEL、曹國文、TOSI等從酸奶中相繼檢測到對四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、氟哌酸、環(huán)丙沙星、慶大霉素、鏈霉素、萬古霉素、利福平、克林霉素及苯唑青霉素耐藥的乳酸桿菌及嗜熱鏈球菌菌株。中國酸奶生產(chǎn)中實際使用菌株的耐藥性情況不詳。為了解國產(chǎn)酸奶中添加的益生菌種類、添加水平、所用菌種對抗生素的耐藥情況,特進行本研究。1材料和方法1.1材料表面1.1.1微生物群體干酪乳酸桿菌干酪亞種(Lactobacilliuscaseisubspcasei)1.2435、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種(Lactobacilliusdelbrueckiisubspbulgaricus)1.2161、植物乳酸桿菌(Lactobacilliusplantanum)1.2158、嗜酸乳酸桿菌(Lactobacilliusacidophilus)1.2686、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)1.2190均購自中國科學(xué)院微生物研究所。糞腸球菌(E.faecalis)ATCC29212、大腸埃希菌(E.coli)ATCC25922均購自中國藥品生物制品檢定所。1.1.2藥品化學(xué)品檢定所需藥物產(chǎn)物的藥物檢定所需藥物生物指標(biāo)gen、氨芐激素、克林路徑erythromicin,ery、輸注erythromicin,ery、輸注ery的藥品檢定所需研究青霉素(penicillin,PEN)、慶大霉素(gentamicin,GEN)、氨芐青霉素(ampicillin,AMP)、萬古霉素(vancomycin,VAN)、克林霉素(clindamycin,CLIN)、紅霉素(erythromycin,ERY)均購自中國藥品生物制品檢定所。1.1.3益生菌種類編碼實驗用酸奶樣品2007年9月~2008年3月間購自北京市3個大型超市,共選購14個廠家生產(chǎn)的保質(zhì)期內(nèi)共計31種酸奶樣品,廠家在樣品標(biāo)簽中標(biāo)識的益生菌種類包括雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌和保加利亞乳酸桿菌中的2種、3種或4種。1.1.4培養(yǎng)基和試劑MRS培養(yǎng)基(BectonDickinson公司)、MH培養(yǎng)基(BectonDickinson公司)、一次性血瓊脂平皿(天津市金章科技發(fā)展有限公司)、BHI培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司)。1.1.5po4、na2hpo4、nacl、鹽酸丙三醇(北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司,分析純);NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl(北京化學(xué)試劑公司,分析純)、鹽酸(北京化學(xué)試劑公司,分析純);革蘭染液、API50CHL細(xì)菌生化鑒定試劑盒(法國Biomerieux公司)。1.1.6nacl的制備分別稱取NaH2PO45.56g、Na2HPO423g、NaCl87.68g于1000ml錐形瓶中,加入適量蒸餾水加熱溶化,補充蒸餾水至1000ml,用鹽酸調(diào)至pH7.4,121℃高壓滅菌15min,使用前用無菌蒸餾水1∶10稀釋。1.1.7儀器、儀器和儀器恒溫培養(yǎng)箱(MIR-262,4℃~50℃±1℃)、高壓滅菌鍋(MSL-3705、日本SANYO公司);厭氧裝置(GENboxJar2.5LREF96127,法國Biomerieux公司)、離心機(AVANTI30,德國BECKMAN公司)、比濁儀(phoenixSpe,BectonDickinson公司)、電子天平(METTLER-AE240,梅特勒-托利多儀器上海有限公司)、顯微鏡(VisionBiomed)。1.2方法1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對乳酸桿菌生長的影響將益生菌各標(biāo)準(zhǔn)菌株分別劃線接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基和一次性血瓊脂培養(yǎng)平皿內(nèi),每個菌株每種培養(yǎng)基接種兩個平皿,倒置后分別放于需氧及厭氧環(huán)境中,(36±1)℃培養(yǎng)48h,進行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。結(jié)果顯示,培養(yǎng)環(huán)境一定的情況下,乳酸桿菌及雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在MRS瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長狀態(tài)良好,在MH瓊脂培養(yǎng)基及一次性血瓊脂培養(yǎng)基上生長不佳;在培養(yǎng)基一定的情況下,厭氧條件下菌落的生長狀況明顯優(yōu)于需氧條件。因此,后續(xù)研究中乳酸桿菌和雙岐桿菌分離鑒定的最佳實驗條件為MRS培養(yǎng)基、(36±1)℃厭氧培養(yǎng)。1.2.2草莓中的生死分離與活菌計數(shù)1.2.2.稀釋液的稀釋無菌操作取充分搖勻的酸奶樣品25ml(g),置于盛有225ml滅菌PBS緩沖液的廣口瓶內(nèi),充分混勻后制成1∶10的稀釋液,用無菌吸管吸取該稀釋液1ml,加入盛有9ml滅菌PBS試管內(nèi),充分混勻后制成1∶100的稀釋液,如此遞增直至稀釋到1∶106。分別吸取1∶104、1∶105及1∶106三個稀釋度的樣品稀釋液1ml于MRS瓊脂培養(yǎng)平皿內(nèi)涂布均勻,每個稀釋度做兩個平行平皿,同時做PBS緩沖液的空白對照。(36±1)℃厭氧培養(yǎng)46~48h觀察結(jié)果。以上自酸奶樣品啟封至接種結(jié)束的整個操作過程必須在20min內(nèi)完成。1.2.2.菌落計數(shù)及革蘭染色取出培養(yǎng)皿,觀察生長出的菌落特征,選取符合益生菌菌落特征、菌落數(shù)在30~300之間的平板按照GB/T4789.35-2003中檢驗程序規(guī)定進行菌落計數(shù),同時挑取菌落進行革蘭染色及過氧化氫酶實驗進行驗證。1.2.3菌株鑒定在進行活菌計數(shù)同時,用無菌接種針挑取所有符合益生菌特征的單個菌落,劃線接種于新鮮的MRS瓊脂培養(yǎng)平皿中,倒置于(36±1)℃厭氧培養(yǎng)16~24h后按照API50CHL鑒定試劑盒說明進行生化鑒定。1.2.4抗抗生素藥物試驗1.2.4.藥物濃度梯度的確定根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)標(biāo)準(zhǔn)確定實驗用各抗生素的濃度梯度,具體見表1。1.2.4.抗菌活性的測定將分離菌株接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基平皿上,(36±1)℃厭氧培養(yǎng)16~20h后,挑取菌落用無菌蒸餾水配成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?用MRS肉湯培養(yǎng)基稀釋100倍后備用。在96孔酶標(biāo)板每孔(第一列除外)中各加入100μl的MRS肉湯培養(yǎng)基,分別取最高濃度的6種抗生素各200μl自上而下依次加至第一列各孔內(nèi),混勻后取出100μl移至第二列相應(yīng)孔中,充分混勻后自左至右依次倍比稀釋,至最后一孔時混勻后取出100μl舍棄(抗生素中濃度梯度多于11者,分別轉(zhuǎn)到96孔酶標(biāo)板最后兩行)。繼爾在各孔中加入100μl制備好的菌懸液,輕微混勻后(36±1)℃培養(yǎng)16~20h后讀取最小抑制濃度(minimuminhibitoryconcentration,MIC),并同時做糞腸球菌及大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)控。按照CLSI的最新規(guī)則及判定標(biāo)準(zhǔn)判讀結(jié)果。2結(jié)果2.1在奶酸樣品中，抗生素的計數(shù)和分離結(jié)果2.1.1樣品含量測定被調(diào)查的31份酸奶樣品來自14個不同生產(chǎn)廠家,活菌計數(shù)范圍為1×104~1.5×108cfu/ml(g),其中低于國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的1×106cfu/ml(g)的有12份樣品(占總樣品數(shù)的38.7%)分屬于6個生產(chǎn)廠家,其中除2廠家各有25%的產(chǎn)品中活菌計數(shù)未達到國家規(guī)定,其他4個廠家多數(shù)產(chǎn)品(50%~100%)不合格。另外19份酸奶樣品(61.3%)中活菌計數(shù)符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。因此,單從活菌計數(shù)而言,本次實驗采集的酸奶產(chǎn)品三分之一不合格。2.1.2蘭染色的結(jié)果52株酸奶樣品分離株革蘭染色結(jié)果顯示,所有菌株均為革蘭陽性,其中革蘭陽性的桿菌37株,革蘭陽性的球菌15株。2.1.3乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌及發(fā)酵乳酸桿菌生長情況生化反應(yīng)結(jié)果將52株酸奶樣品分離菌株分為6個種,其中保加利亞乳酸桿菌24株、嗜熱鏈球菌15株、嗜酸乳酸桿菌7株、干酪乳酸桿菌3株、德氏乳酸桿菌2株及發(fā)酵乳酸桿菌1株。其中,被鑒定為發(fā)酵乳酸桿菌的1株、被鑒定為保加利亞乳酸桿菌的1株、被鑒定為德氏乳酸桿菌的2株、被鑒定為嗜酸乳酸桿菌的2株,廠家在產(chǎn)品標(biāo)簽中并沒有標(biāo)注使用了上述菌種,換言之,使用上述菌種的廠家其產(chǎn)品的標(biāo)簽聲稱與實際使用菌種不符。2.2克林激素、激素的耐藥在實驗的6種抗生素中,所有菌株對青霉素和氨芐青霉素均敏感,對慶大霉素的敏感性均較低。1株菌(編號14-2)對克林霉素和紅霉素雙重耐藥,4株菌(編號3-1、18-1、24-1、24-2)對萬古霉素耐藥。實驗中發(fā)現(xiàn)27%(14/52)的菌株能耐受高于質(zhì)控菌MIC值8倍以上濃度的慶大霉素,其中3株菌(編號3-2、13-1、14-2)對慶大霉素的MIC值是質(zhì)控菌株的16倍以上,表現(xiàn)出較強的耐藥性。3min以上的菌株本次調(diào)查的酸奶有近1/3的產(chǎn)品中活菌計數(shù)未達到國家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn),可能在添加菌種的過程中,沒有做好質(zhì)量控制,混勻不均致使不同批次的產(chǎn)品中含有的益生菌數(shù)量不同;但另有4個廠家多數(shù)產(chǎn)品(50%~100%)不合格。建議各乳制品生產(chǎn)廠家在產(chǎn)品添加菌種的過程中嚴(yán)抓質(zhì)量控制環(huán)節(jié),確保產(chǎn)品內(nèi)益生菌活菌含量達到國家規(guī)定的要求。生化反應(yīng)鑒定結(jié)果將52株酸奶樣品分離菌分為兩大類,即37株乳酸桿菌和15株嗜熱鏈球菌,與革蘭染色結(jié)果基本相符。雖然部分酸奶樣品的商標(biāo)中標(biāo)示添加了雙歧桿菌,但31種酸奶樣品中均沒有檢出雙歧桿菌。其原因可能是:一方面,雙歧桿菌為嚴(yán)格厭氧菌,在有氧條件下20min即可死亡,所以在提取過程中操作時間雖然控制在20min以內(nèi),但難保證雙歧桿菌存活。另一方面,由于雙歧桿菌對培養(yǎng)條件的要求較為苛刻,所以在一般的培養(yǎng)條件下生長較為緩慢,而乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌對培養(yǎng)條件要求相對較為寬松,在(36±1)℃厭氧培養(yǎng)條件下生長良好。所以在培養(yǎng)的過程中,生長良好的乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌成了優(yōu)勢菌,最終導(dǎo)致檢出的細(xì)菌均為乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌。有些酸奶同時標(biāo)示含有嗜熱鏈球菌、保加利亞乳酸桿菌和嗜酸乳酸桿菌等,而生化鑒定結(jié)果顯示分離到的菌株為嗜熱鏈球菌和保加利亞乳酸桿菌,并沒有檢出嗜酸乳酸桿菌,分析其原因可能為:第一,嗜酸乳酸桿菌在培養(yǎng)過程中沒有發(fā)展成優(yōu)勢菌因而沒有被檢出。第二,檢出的菌落較少,形態(tài)特點不明顯而被忽略。第三,廠家根本沒有添加此種細(xì)菌。此外,實驗中還檢出了產(chǎn)品沒有被標(biāo)示的其他菌種。其中發(fā)酵乳酸桿菌雖被其他國家應(yīng)用于嬰兒食品、發(fā)酵乳制品和藥品等生產(chǎn),但在酸奶中應(yīng)用并不廣泛。此外,德氏乳酸桿菌一般不作為添加到發(fā)酵食品中的益生菌。上述兩菌種均沒有被我國列入可用于益生菌類保健食品的菌種名單之列,也未見被許可用于普通的食品生產(chǎn)。這說明,生產(chǎn)廠家在添加菌種的時候并沒有嚴(yán)格按照國家規(guī)定去添加相應(yīng)的菌種,同時也不排除廠家誤加的可能性。本研究結(jié)果顯示,某些酸奶生產(chǎn)廠家使用的菌株耐