hla-i類抗原及cd8分子在宮頸病變組織中的表達(dá)

hla-i類抗原及cd8分子在宮頸病變組織中的表達(dá)

宮頸是女性最常見的腸道腫瘤，也是乳腺癌引起女性癌癥死亡的重要原因。在我國宮頸癌的新發(fā)病例數(shù)亦在逐年增加,且有年輕化的趨勢。研究證明99%以上的宮頸癌合并人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染,故HPV感染是宮頸癌的主要致病原因之一。但是,性行為活躍期的婦女宮頸感染至少一種HPV的終生累積概率可高達(dá)40%。但其中大部分感染可自然消退,即被機(jī)體免疫系統(tǒng)識別清除,只有不到1%的感染過高危型HPV的婦女不能自發(fā)將其清除而形成持續(xù)感染狀態(tài)并最終發(fā)展為宮頸癌。可見宮頸HPV感染僅是宮頸癌的必要條件,而并非充分條件。免疫監(jiān)視系統(tǒng)在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著重要的作用。在免疫系統(tǒng)中,人類白細(xì)胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)系統(tǒng)是重要組成部分,其作用是能夠?qū)⒖乖倪f呈給抗原特意性T細(xì)胞,從而啟動免疫應(yīng)答,最終將“異己”抗原清除體外。HLA抗原共分為三類,其中HLA-I類抗原的主要作用是與加工處理后的內(nèi)源性抗原相結(jié)合形成復(fù)合物并遞呈在細(xì)胞表面,被CD8+T細(xì)胞所識別,從而啟動特異性的殺傷靶細(xì)胞的作用?？梢?HLA-I類抗原在腫瘤的免疫監(jiān)控、免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)等方面具有十分重要的作用。如果HLA-I類抗原表達(dá)異常,則會影響到機(jī)體的有效抗腫瘤免疫應(yīng)答,從而出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸現(xiàn)象,腫瘤細(xì)胞得以生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。本實驗應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)及慢性宮頸炎組織石蠟切片中HLA-I類抗原和CD8分子的表達(dá)情況,以探討其與宮頸癌的相關(guān)性。這可能對宮頸癌的免疫治療起到一定的作用。1材料和方法1.1病例選擇性別背景收集2002年至2004年于中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科手術(shù)治療的病例76例,其中宮頸癌31例(按FIGO2000年修訂的標(biāo)準(zhǔn)臨床分期,I期15例,II期16例;高分化9例,中分化14例,低分化8例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例,無淋巴轉(zhuǎn)移21例),患者年齡25~79歲,平均44.7±9.4歲;CIN22例(CINI9例,CINII2例,CINIII5例,原位癌6例),患者年齡20~73歲,平均44.6±9.5歲;慢性宮頸炎23例,患者年齡35~58歲,平均44.9±9.0歲。所有病例術(shù)前均未行放療、化療及免疫治療。且術(shù)后均經(jīng)病理證實。1.2耐藥基因檢測利用免疫組化SP法檢測HLA-I類抗原及CD8分子的表達(dá)。將石蠟包埋組織制備成4μm厚的組織切片,常規(guī)脫蠟、水化,并以微波法進(jìn)行抗原修復(fù)。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶染色法(SP法)操作步驟按SP試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行。HLA-I兔抗人多克隆抗體(購自SANTACRUZ公司)的工作濃度為1∶150,CD8鼠抗人單克隆抗體(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)的工作濃度為1∶150。PBS代替一抗作為陰性對照。1.3染色細(xì)胞百分?jǐn)?shù)每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)以著色細(xì)胞數(shù)和染色程度綜合判斷,最終結(jié)果是采用雙盲法由兩位病理科醫(yī)師分別觀察所獲得的一致意見。HLA-I類抗原著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù):陰性為0分,≤10%為1分,11%~50%為2分,51~75%為3分,>75%為4分;CD8分子著色細(xì)胞百分?jǐn)?shù):陰性為0分,≤10%為1分,11%~25%為2分,26%~50%為3分,>50%為4分。染色程度:不著色記為0分,淡黃色記為1分,棕黃色記為2分,棕褐色記為3分。兩項得分相乘結(jié)果0~2分記為(-),3~4分記為(+),5~8分記為(++),9~12分記為(+++)。1.4統(tǒng)計分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),進(jìn)行秩和檢驗分析及Spearman秩相關(guān)分析,P<0.05視為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1hla-i類抗原在cin和慢性宮頸炎中的表達(dá)率及耐藥率HLA-I類抗原陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜,細(xì)胞膜呈淺黃到棕褐色著色,細(xì)胞漿亦有黃染,見圖1。HLA-I類抗原在慢性宮頸炎組中陽性表達(dá)率為100.0%(23/23),其中3例表達(dá)(+)、7例表達(dá)(++)、13例表達(dá)(+++),以強(qiáng)陽性表達(dá)為主;在CIN組中的陽性表達(dá)率為100.0%(22/22),其中5例表達(dá)(+)、14例表達(dá)(++)、3例表達(dá)(+++),以陽性表達(dá)為主;在宮頸癌組中的陽性表達(dá)率為22.6%(7/31),其中24例表達(dá)(-)、7例表達(dá)(+),以陰性表達(dá)為主。可見,HLA-I類抗原在宮頸癌組中的表達(dá)率明顯低于CIN組和慢性宮頸炎組(P均<0.01)。HLA-I類抗原在II期宮頸癌組織中的陽性表達(dá)率0.0%(0/16)明顯低于在I期宮頸癌組織中的表達(dá)46.7%(7/15)(χ2=7.160,P=0.007)。且隨著臨床病理分期期別的升高HLA-I類抗原表達(dá)減少甚至無表達(dá)。此外,HLA-I類抗原在低分化組中的表達(dá)低于中高分化組,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,均無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.753,P=0.686;χ2=0.485,P=0.486)(表1)。HLA-I類抗原在CINI~II組中與CINIII~原位癌組中均表達(dá)陽性,未見統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=4.800,P=0.091)。但在CINIII~原位癌組中以陽性和弱陽性表達(dá)為主,在CINI~II組中以陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)為主,HLA-I類抗原在CINIII至原位癌組中的表達(dá)較在CINI~II組有減弱的趨勢(表2)。2.2cd8分子在iii、cd9、pb患者中的表達(dá)率及免疫指標(biāo)CD8分子表達(dá)于淋巴細(xì)胞表面,細(xì)胞膜和細(xì)胞漿呈淺黃到棕褐色著色。淋巴細(xì)胞多分布于間質(zhì)組織,故CD8分子多于間質(zhì)部的淋巴細(xì)胞內(nèi)可見表達(dá),少量CD8分子陽性表達(dá)的淋巴細(xì)胞可見于癌灶組織中(圖2)。CD8分子在慢性宮頸炎組中陽性表達(dá)率為100.0%(23/23),其中3例表達(dá)(+)、5例表達(dá)(++)、15例表達(dá)(+++),以強(qiáng)陽性表達(dá)為主;在CIN組中的陽性表達(dá)率為95.5%(21/22),其中1例表達(dá)(-)、12例表達(dá)(+)、7例表達(dá)(++)、2例表達(dá)(+++),以弱陽性和陽性表達(dá)為主;在宮頸癌組中的陽性表達(dá)率為22.6%(7/31),其中24例表達(dá)(-)、4例表達(dá)(+)、3例表達(dá)(++),以陰性表達(dá)為主。可見,CD8分子在宮頸癌組中的表達(dá)率明顯低于慢性宮頸炎組及CIN組(P均<0.01)。CD8分子在II期宮頸癌組中的陽性表達(dá)率0.0%(0/16)明顯低于在I期宮頸癌組中的表達(dá)46.7%(7/15)(χ2=7.729,P=0.021)。隨著臨床病理分期期別的升高其表達(dá)減少甚至無表達(dá)。此外,CD8分子在不同組織分化程度組間的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.753,P=0.686),雖在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,但無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=0.485,P=0.486)(表1)。CD8分子在CINI~II組中與CINIII~原位癌組中均表達(dá)陽性,未見統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=3.619,P=0.306)。但是在CINIII~原位癌組中以陽性和弱陽性表達(dá)為主,而在CINI~II組中以陽性和強(qiáng)陽性表達(dá)為主,可見CD8分子在CINIII~原位癌組中的表達(dá)較在CINI~II組有減弱的趨勢(表2)。2.3cd8分子間的相關(guān)性HLA-I類抗原在慢性宮頸炎、CIN及宮頸癌組織中的表達(dá)逐漸減少甚至無表達(dá),CD8分子在3組間的表達(dá)亦呈此趨勢,兩者間存在著正相關(guān)(Spearman秩相關(guān)系數(shù)rs=0.808,P<0.0005)(表3)。3對hla-i類抗原和cd8分子在強(qiáng)調(diào)妊娠中的表達(dá)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟的過程。主要決定于病毒因素、宿主因素和環(huán)境協(xié)同因素三個方面。其中宮頸HPV感染僅是宮頸癌的必要條件,而并非充分條件。能否進(jìn)一步發(fā)展為宮頸癌,可能與宿主因素密切相關(guān),其中最重要的宿主因素則是免疫功能。人類白細(xì)胞抗原(HLA)系統(tǒng)在抗腫瘤免疫效應(yīng)中起到十分重要的作用。其中,HLA-I類抗原幾乎存在于所有的有核細(xì)胞表面,它的主要作用是與加工處理后的內(nèi)源性抗原肽相結(jié)合形成復(fù)合物并遞呈在細(xì)胞表面,被CD8+T細(xì)胞所識別,活化后分化的效應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxicTcell,Tc或CTL),通過分泌穿孔素等物質(zhì)直接殺傷靶細(xì)胞,或通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)靶細(xì)胞調(diào)亡,從而實現(xiàn)了特異性的殺傷靶細(xì)胞的作用。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HLA-I類抗原的表達(dá)下調(diào)是腫瘤逃避T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的重要機(jī)制,大約有40~90%的腫瘤合并有HLA-I類抗原的缺乏,如乳腺癌、喉癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等。RvuKS等研究發(fā)現(xiàn)在宮頸癌組織中尤其是在伴有轉(zhuǎn)移的組織中,HLA-I類抗原表達(dá)明顯下調(diào),多由正常組織的陽性表達(dá)轉(zhuǎn)為減弱甚至完全無表達(dá)。HLA-I類抗原的表達(dá)水平下降,導(dǎo)致機(jī)體不能夠把抗原肽遞呈給細(xì)胞毒性T細(xì)胞,從而避開了細(xì)胞毒性T細(xì)胞的特異性殺傷靶細(xì)胞的作用,出現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸現(xiàn)象,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的繼續(xù)生長和轉(zhuǎn)移。而CD8分子則是存在于細(xì)胞毒性T細(xì)胞表面的糖蛋白,為HLA-I類抗原的受體,在HLA-I類抗原介導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞免疫機(jī)制中亦起到至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn),HLA-I類抗原表達(dá)于幾乎所有的有核細(xì)胞表面,但在CIN組織中的異型細(xì)胞中表達(dá)減少,在宮頸癌癌灶組織中表達(dá)減少更為明顯甚至完全無表達(dá),而在癌灶間質(zhì)部位則無明顯變化。而CD8分子則主要表達(dá)于淋巴細(xì)胞表面,故多在宮頸組織的間質(zhì)部位可見到陽性表達(dá),少量CD8分子陽性表達(dá)的淋巴細(xì)胞則會浸潤到癌灶組織中以參與抗腫瘤作用?？傊?本實驗通過計數(shù)發(fā)現(xiàn)HLA-I類抗原及CD8分子在慢性宮頸炎、CIN及宮頸癌組織中的表達(dá)均存在著明顯的差異,在三組間呈逐漸減少的趨勢,可見其表達(dá)與宮頸癌的臨床病理分期密切相關(guān),并且隨著臨床病理分期期別的增高呈明顯減少的趨勢,甚至完全無表達(dá)。亦發(fā)現(xiàn)HLA-I類抗原及CD8分子在慢性宮頸炎、CIN及宮頸癌組織中的表達(dá)亦呈正相關(guān)性。雖二者的表達(dá)與組織分化程度的高低及是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未見統(tǒng)計學(xué)差異,但亦可以看出隨著惡性程度的增高,其表達(dá)有減少的趨勢。本研究針對宮頸癌組織中二者的表達(dá)情況的研究結(jié)果與我國王冬教授等的研究基本相符。此外,我們還對CIN及慢性宮頸炎組織進(jìn)行了研究,通過三種不同程度宮頸病變中二者的表達(dá)情況的對比,看出隨著宮頸病變級別的升高,二者的表達(dá)逐漸減少的趨勢。此結(jié)果提示,可能由于HLA-I類抗原及CD8分子在CIN及宮頸癌組織中的表達(dá)減少甚至無表達(dá),從而細(xì)胞毒性T細(xì)胞無法發(fā)揮其特異性殺傷靶細(xì)胞的作用,繼而導(dǎo)致了HPV感染后所致的異型細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞避開了免疫系統(tǒng)的監(jiān)視作用,出現(xiàn)了免疫逃逸現(xiàn)象,從而腫瘤得以發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移。且考慮其表達(dá)下調(diào)的程度與腫瘤的惡性程度可能存在相關(guān)性,即惡性程度越高其表達(dá)下調(diào)更為明顯。Akash等亦研究證實HLA-