實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)快速檢測(cè)乳酸桿菌

實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)快速檢測(cè)乳酸桿菌

乳腺癌通常存在于乳乳菌（如乳頭、奶裙）中。某些乳酸桿菌如嗜酸乳酸桿菌、保加利亞乳桿菌,常用于飲料等發(fā)酵工業(yè)。也有些常用于生物檢定,如乳酪乳桿菌被廣泛應(yīng)用于各種維生素B和各種氨基酸的檢定、李氏乳桿菌用于維生素B12的微生物學(xué)檢定。而有一些乳酸菌,特別是乳桿菌可以在含酒花物質(zhì)的啤酒中生長(zhǎng),是啤酒腐敗的主要細(xì)菌。由于16SrDNA序列的高度保守性,現(xiàn)代微生物中利用16SrDNA序列來鑒定微生物的種類已被廣泛運(yùn)用。鄭飛云等人根據(jù)細(xì)菌16SrDNA序列的特點(diǎn),設(shè)計(jì)合成了針對(duì)啤酒污染乳酸桿菌的引物。國(guó)外已將real-timePCR技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌的檢測(cè)和控制,然而在國(guó)內(nèi),相關(guān)的研究卻相對(duì)較少。本文根據(jù)乳酸桿菌16SrDNA序列的特征,設(shè)計(jì)合成了針對(duì)乳酸桿菌的引物和Taqman探針,驗(yàn)證了real-timePCR方法在乳酸桿菌鑒定中的高度特異性、靈敏性、以及簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。1材料和方法1.1菌株和菌株本研究所用植物乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌,嗜熱鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司;其他菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離得到。1.2儀器和試劑1.2.1儀器ABIPRISM7500FastReal-TimePCR基因擴(kuò)增儀;臺(tái)式高速離心機(jī);恒溫振蕩器;厭氧罐。1.2.2試劑MRS培養(yǎng)基、TJA培養(yǎng)基等;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及PremixExTaqTM等試劑(大連寶生物工程有限公司)。1.3測(cè)試方法1.3.1細(xì)菌培養(yǎng)的測(cè)定將菌株接種于20mLMRS液體培養(yǎng)基中,分別在有氧和厭氧條件下,于37℃恒溫培養(yǎng)48±3h,以提高細(xì)菌檢出率。采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(貨號(hào)D9093),按其操作說明提取細(xì)菌基因組DNA。1.3.2實(shí)時(shí)熒光rcr1.3.2.引物及探針的建立通過乳酸桿菌屬的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)它們之間具有很高的同源性。運(yùn)用ABI的PrimerExpress及DNAstar中的PrimerSelect軟件,在同源性較高的區(qū)域選擇設(shè)計(jì)了乳酸桿菌的通用引物及探針:⑴引物序列,正向引物5’-AGCGAAGGATATGGAGAGTAGAAATACT-3’;反向引物5’-CGGTTTTTTGCTTGGATTATATTCA-3。⑵探針:5’-CCAGAGCAAGCGGAAGCACACTAAGAAAC-3’。本研究的引物和探針由寶生物工程(大連)有限公司合成。其中探針的5’端標(biāo)記FAM,3’端標(biāo)記TAMRA。1.3.2.熒光探針roxrewelle-pcrPremixExTaqTM(2×)12.5μL,10μmol/L引物各0.5μL,10μmol/L熒光探針溶液1μL,ROXReferenceDyeⅡ(50×)0.5μL,DNA模板2μL,加滅菌雙蒸水使總體積為25μL。1.3.2.3反應(yīng)條件95℃,預(yù)變性10s;95℃,5s;60℃,34s,40個(gè)循環(huán)。1.3.2.實(shí)時(shí)熒光pcr和外源基因檢測(cè)⑴循環(huán)閾值(cyclethreshold,Ct值)≤35,表明PCR過程中有目標(biāo)DNA的擴(kuò)增,可直接判定為陽(yáng)性;⑵待檢樣基因檢測(cè)Ct值在36~40之間,應(yīng)重做實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增;再次擴(kuò)增后的外源基因Ct值仍小于40,且曲線有明顯的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,并且陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常,則可判定為陽(yáng)性;再次擴(kuò)增后外源基因Ct值大于40,且陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照結(jié)果正常,可判定為陰性。1.3.3真實(shí)菌密度的測(cè)定取乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分別于選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)一定時(shí)間,測(cè)其A值,估計(jì)其菌數(shù),然后按10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,10-7,10-8的倍數(shù)稀釋,取最后幾個(gè)梯度的菌液涂平板計(jì)數(shù),重復(fù)3次,取其平均值確定其真實(shí)的菌密度。同時(shí)每個(gè)梯度菌液各取3管進(jìn)行熒光PCR檢測(cè),將檢測(cè)結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果比較,確定反應(yīng)體系的靈敏度。1.3.4實(shí)時(shí)熒光pcr的特異性檢測(cè)乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌,腸炎沙門氏菌、浦那沙門、金黃色葡萄球菌、單增李斯特、福氏志賀菌、弗地勞枸櫞酸桿菌、奇異變形桿菌、耶爾森產(chǎn)氣腸桿菌分別在肉湯增菌液中培養(yǎng),提取細(xì)菌DNA,把以上幾種細(xì)菌DNA等量混合,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR,檢驗(yàn)方法的特異性。2結(jié)果與分析2.1開口試驗(yàn)的結(jié)果2.1.1稀釋梯度如圖1所示,圖中由左至右與基線相交的陽(yáng)性擴(kuò)增線分別表示:10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6稀釋梯度。由圖1可見,熒光PCR可檢出至10-6梯度,根據(jù)平板計(jì)數(shù)可得出檢測(cè)的濃度為83CFU/mL。2.1.2稀釋梯度如圖2所示,圖中由左至右與基線相交的陽(yáng)性擴(kuò)增線分別表示:10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6稀釋梯度。由圖2可見,熒光PCR可檢出至10-6梯度,根據(jù)平板計(jì)數(shù)可得出檢測(cè)的濃度為100CFU/mL。2.1.3稀釋梯度如圖3所示,圖中由左至右與基線相交的陽(yáng)性擴(kuò)增線分別表示:10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋梯度。由圖3可見,熒光PCR可檢出至10-7梯度,根據(jù)平板計(jì)數(shù)可得出檢測(cè)的濃度為40CFU/mL。2.2特異性試驗(yàn)的結(jié)果從圖4可以看出,乳酸桿菌到了擴(kuò)增,而所有非乳酸桿菌均沒有檢測(cè)到熒光信號(hào),說明實(shí)時(shí)熒光PCR在檢測(cè)乳酸桿菌方面均具有很好的特異性。3pcr檢測(cè)乳酸桿菌的方法目前常用的檢測(cè)方法是厭氧平板培養(yǎng)法,即待長(zhǎng)出菌落后用肉眼直觀檢測(cè)。乳酸桿菌屬細(xì)胞形態(tài)多樣,從長(zhǎng)的和細(xì)長(zhǎng)狀到彎曲形及短桿,也常有揮形球桿狀,一般形成鏈。通常不運(yùn)動(dòng),運(yùn)動(dòng)者則具有周生鞭毛。無芽孢,革蘭氏染色陽(yáng)性。這種方法最大的缺陷是費(fèi)時(shí),5~7d才可看到結(jié)果,不能夠及時(shí)反饋微生物的污染狀況。乳酸桿菌屬細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)要求復(fù)雜,培養(yǎng)特性比較特殊,而且傳統(tǒng)平板培養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢,分離培養(yǎng)鑒定周期約需7~9d,因此建立快速檢測(cè)和鑒定乳酸桿菌的檢驗(yàn)方法勢(shì)在必行。傳統(tǒng)PCR方法一直面臨著兩大難題,即PCR的假陽(yáng)性污染和定量的準(zhǔn)確度。近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-timequantitativePCR)技術(shù)克服了這兩大難題,實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。乳酸桿菌屬中已被描述的有56個(gè)種,根據(jù)這一特點(diǎn)本文設(shè)計(jì)了擴(kuò)增乳酸桿菌屬各種乳酸桿菌的通用引物。在實(shí)時(shí)熒光PCR中,使用乳酸桿菌通用引物,乳酸桿菌種出現(xiàn)特異性擴(kuò)增,非乳酸桿菌都未出現(xiàn)特異