宮頸癌組織凋亡相關(guān)蛋白survilin、fas、fasl表達(dá)與臨床病理對(duì)照研究

宮頸癌組織凋亡相關(guān)蛋白survilin、fas、fasl表達(dá)與臨床病理對(duì)照研究

死亡不僅在正常的生理調(diào)整中起著重要作用，而且在惡意病變的過(guò)程中也起著重要作用。細(xì)胞凋亡過(guò)程受凋亡抑制基因與凋亡活化基因的共同調(diào)節(jié)。Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)的家族成員,具有明確的抗凋亡作用。Fas是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的信號(hào)分子。Fas/FasL屬于TNF/NGF受體家族,FasL與Fas的交聯(lián)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在誘發(fā)細(xì)胞凋亡、維持機(jī)體自身穩(wěn)定和保持內(nèi)環(huán)境平衡等方面起著重要的作用。Fas與自然存在的FasL結(jié)合將啟動(dòng)凋亡信號(hào),導(dǎo)致Fas陽(yáng)性細(xì)胞在數(shù)小時(shí)內(nèi)凋亡。Survivin與Fas共同作用于在凋亡通路中發(fā)揮決定作用的Caspase3和Caspase7。本研究擬觀察Survivin和Fas/FasL系統(tǒng)在正常宮頸、慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤樣變(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)和宮頸癌中的表達(dá)及其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的臨床意義。1數(shù)據(jù)和方法1.1患者年齡分布宮頸組織標(biāo)本取自上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科2001年1月—2008年12月行子宮手術(shù)或?qū)m頸活檢者,標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師復(fù)閱HE染色切片證實(shí);其中宮頸癌47例,CIN25例,慢性宮頸炎20例,正常宮頸組織標(biāo)本20例。47例宮頸癌患者的年齡為25～52歲,中位年齡38歲;鱗癌42例,腺癌5例;按分化程度為高分化15例,中分化29例,低分化或未分化3例;臨床分期(FIGO,2000)為Ⅰa期5例,Ⅰb～Ⅱa期39例,Ⅱb～Ⅲ期3例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例,未轉(zhuǎn)移17例(完成手術(shù)者經(jīng)病理檢查診斷,未手術(shù)者根據(jù)MRI診斷)。所有患者術(shù)前均無(wú)放療和化療史。20例CIN患者的年齡為25～49歲,中位年齡37歲;CINⅠ級(jí)9例,CINⅡ級(jí)11例,CINⅢ級(jí)5例。20例慢性宮頸炎患者的年齡為30～55歲,中位年齡42歲。20例正常宮頸者的年齡為25～51歲,中位年齡38歲。各組間年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。1.2實(shí)驗(yàn)試劑與方法宮頸組織標(biāo)本做4μm連續(xù)切片,行免疫組織化學(xué)染色(SP法)。一抗Survivin兔抗人多克隆抗體、Fas兔抗人多克隆抗體、FasL兔抗人多克隆抗體均為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品;通用型免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。一抗工作濃度均為1∶100。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片脫蠟,以微波枸櫞酸鹽進(jìn)行抗原修復(fù),DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、透明、封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。用已知的陽(yáng)性乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照,以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。1.3半定量分析結(jié)果切片經(jīng)病理科醫(yī)師證實(shí)有抗原表達(dá)及定位,Survivin、Fas和FasL均以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。高倍鏡(×400)下綜合細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):不著色為0分,黃色為1分,棕黃色為2分,黃褐色為3分。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野,計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性細(xì)胞<10%者為0分,10%～40%者為1分,40%～70%者為2分,≥70%者為3分。兩項(xiàng)評(píng)分相加,0～1分為(-),2分為(+),3～4分為(++),5～6分為(+++);其中(-)為陰性,(+～+++)為陽(yáng)性。1.4計(jì)數(shù)資料比較及相關(guān)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher精確概率法;相關(guān)分析采用Spearman秩相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1正常乳房組織、慢性宮頸炎組織和cin組織的表達(dá)差異Survivin陽(yáng)性細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1);Fas和FasL主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜(圖2、3)。不同宮頸組織中Survivin、Fas和FasL的表達(dá)見(jiàn)表1。Survivin和FasL在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織和CIN組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且兩者在正常宮頸組織中均不表達(dá)。Survivin在CIN組織中的陽(yáng)性表達(dá)率與慢性宮頸炎組織相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與正常宮頸組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但Survivin在慢性宮頸炎組織和正常宮頸組織中的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FasL在CIN組織與慢性宮頸炎組織的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但均明顯高于正常宮頸組織(P<0.05)。Fas在宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率均低于正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織和CIN組織(P<0.05);但正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織和CIN組織間的陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.2asl陽(yáng)性表達(dá)率及與fas表達(dá)的關(guān)系采用Fisher精確概率法分析47例宮頸癌患者Survivin、Fas和FasL的表達(dá)(表2)。其中,在<35歲患者與≥35歲患者間,Survivin、Fas和FasL陽(yáng)性表達(dá)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Survivin的表達(dá)與宮頸癌臨床分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.043,P=0.008),與病理分級(jí)、組織類(lèi)型、腫瘤生長(zhǎng)類(lèi)型無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。Fas的表達(dá)與宮頸癌臨床分期、病理分級(jí)、組織類(lèi)型、腫瘤生長(zhǎng)類(lèi)型、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。FasL的表達(dá)與宮頸癌臨床分期、病理分級(jí)、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P=0.034,P=0.049,P=0.042),但與組織類(lèi)型和腫瘤生長(zhǎng)類(lèi)型無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。2.2fas表達(dá)在Survivin表達(dá)陽(yáng)性的32例宮頸癌組織中,10例Fas表達(dá)陽(yáng)性,32例FasL表達(dá)陽(yáng)性;在Survivin表達(dá)陰性的15例宮頸癌組織中,13例Fas表達(dá)陽(yáng)性,12例FasL表達(dá)陽(yáng)性;Survivin與Fas的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.517,P<0.01),與FasL的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.381,P<0.01)。在FasL表達(dá)陽(yáng)性的44例宮頸癌組織中,21例Fas表達(dá)陽(yáng)性;在FasL表達(dá)陰性的3例宮頸癌組織中,2例Fas表達(dá)陽(yáng)性;FasL與Fas的表達(dá)相關(guān)性不顯著(r=-0.093,P>0.05)。3不同病理組織學(xué)檢測(cè)faol表達(dá)在正常提高和fas陽(yáng)性表達(dá)率中的作用Survivin是IAP家族中最小的成員,它由定位在人染色體17q25位點(diǎn)的單拷貝基因編碼,是含有142個(gè)氨基酸、相對(duì)分子質(zhì)量為16500的蛋白,具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的作用。Survivin在大多數(shù)終末分化組織中缺失或低表達(dá),而在大多數(shù)人實(shí)質(zhì)性腫瘤和血液惡性腫瘤中強(qiáng)表達(dá),與腫瘤的發(fā)病、侵潤(rùn)及預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示Survivin表達(dá)與宮頸癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),與上述結(jié)論一致,提示Survivin作為一個(gè)腫瘤特異性因子,在宮頸癌預(yù)測(cè)患病危險(xiǎn)度中有應(yīng)用價(jià)值。Survivin主要通過(guò)以下兩種途徑抑制凋亡:第一,Survivin可通過(guò)細(xì)胞周期依賴(lài)激酶(cyclin-dependentkinase,CDK)調(diào)節(jié)凋亡,通過(guò)促進(jìn)CDK4釋放p21而抑制凋亡;第二,Survivin可與激活的Caspase3和Caspase7結(jié)合,阻止由Caspase激活劑或凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的細(xì)胞DEVD-cleaving自殺酶的累積;而Caspase3是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的重要通路,Survivin/CDK4復(fù)合物形成后引起p21釋放,并與線粒體內(nèi)的Caspase3相互作用而抑制由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而有報(bào)道顯示,Survivin抑制激活Caspase9,并不抑制激活的Caspase3和Caspase7,這可能可以解釋本實(shí)驗(yàn)中為何Survivin與Fas的結(jié)果并不一致。Fas是一種由定位于人染色體10q23的Fas基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白,相對(duì)分子質(zhì)量為45000,在細(xì)胞凋亡中起調(diào)節(jié)作用。FasL是腫瘤壞死因子家族的一種Ⅱ型跨膜蛋白,定位在人染色體1q23,相對(duì)分子質(zhì)量為40000,它與其受體結(jié)合介導(dǎo)凋亡。FasL/受體的相互作用在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和腫瘤進(jìn)展中起到重要作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),許多腫瘤細(xì)胞通過(guò)其表面Fas和FasL,不但能有效逃避機(jī)體淋巴細(xì)胞的攻擊,而且還能主動(dòng)殺死與之接觸的免疫活性細(xì)胞,導(dǎo)致免疫治療失敗。本研究發(fā)現(xiàn),FasL在正常宮頸組織、慢性宮頸炎組織、CIN組織和宮頸癌組織中呈現(xiàn)的表達(dá)逐級(jí)升高且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,尤其是在慢性宮頸炎細(xì)胞中的表達(dá)相比正常細(xì)胞升高,提示FasL能有效促進(jìn)細(xì)胞逃避淋巴細(xì)胞的攻擊,足以解釋經(jīng)久未愈的慢性宮頸炎患者容易罹患CIN和宮頸癌的臨床現(xiàn)象,驗(yàn)證了慢性炎癥在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用。目前公認(rèn)宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是由宮頸不典型增生(輕→中→重)→原位癌→早期浸潤(rùn)癌→浸潤(rùn)癌的連續(xù)發(fā)展過(guò)程,因此與國(guó)內(nèi)其他研究不同的是本研究比較了Survivin、Fas、FasL在正常組織、慢性宮頸炎組織、CIN組織和宮頸癌組織中的表達(dá)差異,按宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的連續(xù)過(guò)程比較3個(gè)指標(biāo)的表達(dá)差異。本研究發(fā)現(xiàn),Fas在宮頸癌陽(yáng)性表達(dá)率遠(yuǎn)低于正常宮頸組織,提示在宮頸癌的發(fā)生中可能存在Fas抗原缺失,這可能是宮頸癌發(fā)病機(jī)制之一。宮頸癌組織中FasL表達(dá)陽(yáng)性率與宮頸癌的臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示宮頸癌組織中FasL表達(dá)陽(yáng)性率的高低可以反映病變惡性程度及病程進(jìn)展。本研究結(jié)果還顯示,FasL在宮頸癌及在CIN中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織,提示宮頸癌的發(fā)生與FasL表達(dá)上調(diào)有關(guān);表明腫瘤細(xì)胞表達(dá)FasL,并可以通過(guò)促進(jìn)體內(nèi)Fas陽(yáng)性的淋巴細(xì)胞凋亡逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。FasL在慢性宮頸炎、宮頸CIN、宮頸癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率逐步升高以及在宮頸CIN組織中的高表達(dá)提示,FasL的影響出現(xiàn)于病變進(jìn)程的早期,當(dāng)FasL表達(dá)不能下調(diào)時(shí)通過(guò)抑制宿主的免疫系統(tǒng),CIN將發(fā)展為浸潤(rùn)癌,與目前公認(rèn)的宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的連續(xù)過(guò)程一致且密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn),FasL表達(dá)與宮頸癌的臨床分期、病理分級(jí)有關(guān),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者FasL陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,提示FasL高表達(dá)者預(yù)后較差;更為重要的是FasL還與病變進(jìn)程密切相關(guān),而Survivin表達(dá)僅與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示FasL可作為宮頸癌患者病程進(jìn)展和預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。Fas/FasL系統(tǒng)的生理功能在于通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié),限制某些細(xì)胞群落的過(guò)度膨脹或萎縮,參與正常細(xì)胞增殖、分化和凋亡動(dòng)態(tài)平衡的維持,在臨床多種疾病的發(fā)生過(guò)程中具有重要的作用。Fas作為一種普遍表達(dá)的受體分子,可出現(xiàn)于多種細(xì)胞表面;但FasL的表達(dá)卻有其特點(diǎn),通常只出現(xiàn)于活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞,因而已被活化的殺傷性免疫細(xì)胞往往能夠最有效地以凋亡途徑殺死靶細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),大多數(shù)良性腫瘤Fas的表達(dá)類(lèi)似于其來(lái)源的正常組織,而惡性腫瘤的Fas表達(dá)明顯下調(diào)或缺失,逃避體內(nèi)Fas/FasL系統(tǒng)對(duì)其的清除作用。本研究對(duì)上述3個(gè)指標(biāo)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),Survivin與Fas/FasL系統(tǒng)的表達(dá)有相關(guān)性,這與上述Survivin抵制凋亡的機(jī)