1例凝血因子缺陷癥及其家系基因突變的分析

1例凝血因子缺陷癥及其家系基因突變的分析

遺傳因素（f））缺陷是由f突變引起的一種正常的染色體隱性遺傳疾病，可由男女所有。發(fā)病率為1/500000。體外測定FⅦ活性(FⅦactivity,FⅦ∶C)與臨床表型無明顯的相關性,基因突變可較好的解釋其臨床表型變化。純合性和雙雜合性的基因突變臨床出血較嚴重,而雜合性突變幾乎無臨床癥狀。我們對1例遺傳性FⅦ缺陷癥及其家系成員的FⅦ基因突變進行檢測,并研究基因突變與臨床表型的關系。1病例和方法1.1從女性方面分析服刑人員被高校思想家系來自浙江溫嶺市,調查了3代8個成員,先證者為一中年女性,有皮下出血史。2001年因急性闌尾炎術前檢查,因其凝血酶原時間(prothrombintime,PT)延長而被發(fā)現(xiàn),其父母非近親結婚,家系其他成員無出血癥狀。1.2血小板凝血指標測定外周靜脈采血,用0.109mol/L的枸櫞酸鈉按1∶9抗凝,4℃4000r/min離心15min,分離血小板血漿,分裝后-80℃保存,用于凝血指標的測定。按常規(guī)低滲法抽提DNA,-80℃保存,用于PCR擴增。1.3凝固點法檢測fbg、因子活性PT、活化部分凝血活酶時間(activatedpartialthromboplastintime,APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen,Fbg)、因子Ⅱ活性(factorⅡactivity,FⅡ∶C)、因子Ⅴ活性(factorⅤactivity,FⅤ∶C)、因子Ⅶ活性(factorⅦactivity,FⅦ∶C)、因子Ⅷ活性(factorⅩⅢactivity,FⅧ∶C)、因子Ⅸ活性(factorⅨactivity,FⅨ∶C)、因子Ⅹ活性(factorⅩactivity,FⅩ∶C)檢測均應用法國Stago公司試劑盒,在Stago全自動血凝儀上用凝固點法進行檢測。1.4第1和第7第3類共設計了10對引物以覆蓋FⅦ基因的外顯子及其側翼以及啟動子區(qū)域。因第3外顯子和第4外顯子很小且其間的第3內含子較小,用1對引物加以覆蓋;而第8外顯子又過于龐大,故將其人為分為兩個區(qū)域,分別設計了兩對引物;第1外顯子的一部分是選擇性表達的,將這部分單獨擴增,因此也設計兩對引物;其它外顯子及啟動子分別設計1對引物(表1),用PrimerExpress軟件自行設計引物,并在391DNA合成儀(AppliedBiosystems,USA)上合成。1.5pcr擴增序列100μl的PCR反應體系包括:1×PCR緩沖液,1.5mmol/LMgCl2,0.25mmol/LdNTPs,0.5μmol/L5′端和3′端PCR引物,500ngDNA模板,2.5UTaqDNA聚合酶(PCR反應試劑均為TaKaRa公司產(chǎn)品)。PCR反應在DNA熱循環(huán)儀(Perkin-ElmerCetus9600,USA)上進行,反應條件:95℃變性30s;根據(jù)引物的不同分別在57～60℃退火30s;72℃延伸30s,30個循環(huán)。其中3、4號引物所擴增序列內部存在二級結構,采用降落PCR法擴增。反應條件為:97℃變性20s;62℃退火45s;72℃延伸90s,5個循環(huán);95℃變性20s;60℃退火45s;72℃延伸90s,25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物5μl在1.6%瓊脂糖凝膠上電泳,用DL2000標記鑒定。1.6abi37測序PCR產(chǎn)物進行割膠純化(德國QIAGEN公司DNA膠回收試劑盒),以制備測序模板,采用雙脫氧鏈終止法在ABI377測序儀上進行測序,用Chromas軟件在Blaster上將測序結果與正常序列進行比對,尋找基因突變。發(fā)現(xiàn)基因突變的序列反向測序證實。1.7pgemt-行走方便將含突變序列克隆入pGEMT-easy質粒載體中,所得兩條染色體相應序列分別測序,以確定兩個不同等位基因突變所在及性質。1.8突變體測定取純化的PCR產(chǎn)物15μl(約500ng),加MspⅠ5U,10×緩沖液2μl,0.1%BSA2μl,滅菌雙蒸水補足20μl,37℃水浴酶切2h,20g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結果,證實測序所發(fā)現(xiàn)突變。2結果2.1各c的覆蓋范圍先證者PT延長,APTT正常,FⅡ∶C、FⅤ∶C、FⅧ∶C、FⅨ∶C及FⅩ∶C均在正常值范圍內;FⅦ∶C<1%。家系其他成員的PT、APTT均正常,FⅦ∶C降低或正常(圖1,表2)。2.2pgemt-導質粒雜合性突變FⅦ基因突變以美國NCBI基因庫(GenBank)所公布的GI180333和J02933序列為標準,通過對FⅦ外顯子及其側翼以及啟動子的測序發(fā)現(xiàn):先證者(Ⅱ3)在第8外顯子中有兩種基因突變:11348位C→T和11349位G→A,為雙重雜合突變(圖2)。pGEMT-easy質粒克隆測序結果為兩種突變分別位于不同的染色體上,為不同染色體同一編碼區(qū)Arg(CGG)304Trp(TGG)和Arg(CGG)304Gln(CAG)雙重雜合性突變。其父親(Ⅰ1)、母親(Ⅰ2)分別為11349位G→A(Arg304Gln)和11348位C→T(Arg304Trp)雜合突變;先證者的弟弟(Ⅱ4)FⅦ基因為正常野生型;其哥哥(Ⅱ1)和先證者的一個女兒(Ⅲ2)為11349位G→A(Arg304Gln)雜合突變,另一個女兒(Ⅲ1)和一個兒子(Ⅲ3)均為11348位C→T(Arg304Trp)雜合性突變(圖1)。2.3ga基因突變擴增第8外顯子第2部分498bp片段,用Webcutter2.0DNA限制性酶切軟件分析,該序列有3個MspⅠ(識別C/CGG序列)酶切位點,被切成67bp、80bp、117bp和234bp4個片段;當11348位C→T和11349位G→A突變時,11347位酶切位點消失,被切成67bp、197bp和234bp3個片段;若患者為雜合子,則分別包含1條正常和突變的等位基因,498bp被切成67bp、80bp、117bp、197bp和234bp5個片段,利用這一特征鑒定先證者及其家系成員的突變基因。發(fā)現(xiàn)先證者的PCR產(chǎn)物被切成67bp、197bp和234bp3個片段,而其父母、哥哥、3個子女則出現(xiàn)67bp、80bp、117bp、197bp和234bp5個片段,說明均為雜合性突變,其弟弟呈現(xiàn)了67bp、80bp、117bp和234bp野生基因的4個片段(圖3)。3crg304gln突變與tf基因雜合性突變的關系據(jù)最新的FⅦ數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計,FⅦ突變有124種,包括錯義、無義、剪切位點、啟動子、小的插入和缺失6種突變。其中錯義突變約占70%。本文先證者有兩種錯義突變:11348位C→T和11349位G→A的雙重雜合突變。其父親、母親分別為11349位G→A和11348位C→T雜合突變,結合pGEMT-easy質?？寺y序結果,可以證實先證者的兩種突變分別位于不同的染色體上,一個來自父親,一個來自母親,導致不同染色體同一編碼區(qū)Arg304Gln和Arg304Trp的替換。先證者哥哥為11349位G→A(Arg304Gln)雜合突變;先證者3個子女均為雜合突變,突變均來源于先證者。先證者兩種錯義突變均發(fā)生在CpG二核苷酸的突變熱點上,發(fā)生的部位在FⅦ最易發(fā)生突變的第8外顯子上。Matsushita等首次報道1例Arg304Trp純合突變。先證者為1名37歲的日本男性,無自發(fā)性出血史,在常規(guī)凝血檢查中因PT延長而被發(fā)現(xiàn)。用兔組織凝血活酶測定,其FⅦ∶C小于5%,用重組人組織因子(tissuefactor,TF)測定其FⅦ∶C水平為16%,FⅦ∶Ag含量正常。Arg304Gln純合性突變也有報道,首例患者無臨床出血癥狀,用兔組織凝血活酶測定其FⅦ∶C小于1%,而用TF測定FⅦ∶C水平為30%,用兔組織凝血活酶和人TF測定結果的差異是由于不同種屬間TF基因結構特異性造成的。本研究中先證者的FⅦ∶C<1%(用兔組織凝血活酶測定),有皮下出血史,即臨床表型為輕度出血,與其活性測定水平無明顯相關性,表明用非人組織凝血活酶測定的FⅦ∶C不能預測患者的臨床表型。經(jīng)驗和數(shù)學模型研究表明,FⅦ含量占FⅦ生理水平的0.05%時,即足以誘導凝血,更說明了非人TF測定FⅦ∶C的臨床應用的局限性。先證者為Arg304Trp和Arg304Gln雙重雜合突變,其FⅦ∶C水平與純合性的Arg304Trp或Arg304Gln突變相似。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)了兩例純合性的Arg304Trp突變,均無臨床出血表現(xiàn),而在所發(fā)現(xiàn)的16例純合性Arg304Gln突變中,有兩例臨床癥狀不清,10例無臨床癥狀,3例輕度出血,1例中度出血。雖有一定的異質性,但臨床表現(xiàn)多不嚴重。本例雙重雜合突變與其純合突變臨床表現(xiàn)相似。由此可見,血友病A、B的出血程度,與血漿FⅧ∶C、FⅨ∶C的水平明顯相關,但FⅦ缺陷患者的臨床表型與實驗檢查結果無明顯相關性,其原因尚待進一步研究。研究表明,Arg304位于FⅦ結構的保守區(qū),相當于其它維生素K依賴的凝血因子FⅡArg490、FⅨArg333、FⅩArg298的保守區(qū)。Giannelli等研究發(fā)現(xiàn)FⅨArg333Gln突變可能在空間結構上影響其與FⅧ結合而引起重型血友病B,患者表現(xiàn)為交叉反應物質陽性(cross-reactingmaterialpositive,CRM+),根據(jù)分子模型圖發(fā)現(xiàn)FⅦArg304和FⅨArg333為同源結構。表明Arg304位點突變會影響FⅦ的功能。O′Brien等進一步研究表明其功能異常是由于Arg304突變影響FⅦ與TF結合。FⅦ是外源性凝血途徑的始動因子,與TF結合是加速FⅦ向FⅦa轉化的關鍵步驟。體外試驗發(fā)現(xiàn),Arg304Trp突變的FⅦ在TF出現(xiàn)時也不易被FⅩa活化,但Arg304Trp突變的FⅦa能象正常FⅦa一樣活化FⅩa,這一試驗表明,Arg304Trp突變與人TF結合力降低,而其酶催化活性正常,即很可能是由于因子Ⅶ·組織因子,組織因子·活化的因子Ⅶ·因子Ⅹ及活化的因子Ⅹ·組織因子·因子Ⅶ復合物形成異常所致。蛋白質空間結構分析表明,Arg304Trp或Arg333Gln氨基酸的替代導致了精氨酸疏水側鏈被色氨酸或谷氨酰胺的親水側鏈替代,使Arg304附近催化區(qū)的Ⅲ級結構發(fā)生改變,這種結構變化可能