人胰腺癌阿霉素耐藥細胞株sw950adm的建立及耐藥機理研究

人胰腺癌阿霉素耐藥細胞株sw950adm的建立及耐藥機理研究

多藥殘留基因mdr1是許多腫瘤化療失敗的原因之一。外瘤抗生素的形成對闡明腫瘤的抗藥機和篩選化療藥物具有重要的理論和實踐價值。我們的先期研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌細胞株SW1990的先天性耐藥與多藥耐藥基因mdr1的表達呈正相關性。在此基礎上,我們試圖通過建立胰腺癌耐藥細胞株,以進一步探討其獲得性耐藥機理。1材料和方法1.1rt-pcr試劑阿霉素(ADM)等化療藥物由日本明治制藥有限公司出品;MTT為FIUKA公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑購于美國Gibco公司;Rhodamine123(羅丹明)為美國Sigma公司產(chǎn)品;人胰腺癌細胞株SW1990由解放軍總醫(yī)院腫瘤生物研究室提供使用。1.2細胞死亡情況觀察采用濃度梯度倍增法誘導建立耐藥細胞株SW1990/ADM。首先分別向生長有SW1990細胞株的培養(yǎng)瓶內加入不同濃度的ADM,培養(yǎng)1周后觀察細胞死亡情況。選擇可將80%的細胞殺死的藥物濃度(ID80)作為耐藥細胞培養(yǎng)的起始濃度;然后將腫瘤細胞置于含有ID80藥物的培養(yǎng)液中培養(yǎng),24h后更換不含藥物的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞穩(wěn)定生長、進入對數(shù)生長期后,傳代兩次,再將細胞株于加倍劑量(2×ID80)的ADM中繼續(xù)培養(yǎng);依此類推,共經(jīng)過9個濃度梯度、約10個月的培養(yǎng),最后脫藥培養(yǎng)2個月后備用。1.3sw1990對adm菌的生物學特性的檢測1.3.1社會學觀察將兩株細胞分別爬片后經(jīng)HE染色,光鏡下進行形態(tài)學觀察;再分別收集兩株細胞,固定后電鏡下行超微結構觀察。1.3.2通過微分時間測定和微細胞周期分析細胞培養(yǎng)和復孔觀察取對數(shù)生長期的親本及耐藥細胞各一瓶,0.25%胰酶消化,10%小牛血清-1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個/ml的單細胞懸液,24孔板中每孔接種1ml,37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個復孔計數(shù)活細胞,計算平均值,連續(xù)觀察7d。以培養(yǎng)時間為橫軸,以細胞數(shù)的對數(shù)為縱軸,繪制半對數(shù)細胞生長曲線,于生長曲線上對數(shù)生長期內取3組數(shù)據(jù),根據(jù)最小二乘法進行直線回歸,在直線上任取兩點(N、N0),根據(jù)下列公式計算細胞的倍增時間(dt)(式中t代表N0～N的時間):dt=0.693tlgΝΝ0dt=0.693tlgNN02.細胞周期分析取對數(shù)生長期的親本及耐藥細胞各1×106個/ml,制成單細胞懸液,按試劑盒說明進行操作,于流式細胞儀(FCM)上行細胞周期分析。1.3.3cea及ca19-9對cea、ca19-9、cea、ca19-9細胞培養(yǎng)液的制備分別將同等數(shù)量的親本及耐藥細胞接種于培養(yǎng)瓶內,37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng),待細胞進入對數(shù)生長期后,分別收集培養(yǎng)液各10ml,1000r/min離心5min后取上清,行CEA及CA19-9的檢測。1.4化療藥物的復孔、化療聯(lián)合拉米、mmc的制備收集親本及耐藥胰腺癌細胞株,分別制成濃度為5×104個/ml的單細胞懸液,接種于96孔板,每孔200μl。實驗分兩組:①單純化療組,分別加入4種不同濃度梯度的化療藥物,即氟尿嘧啶(5-FU,0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml、5000μg/ml)、健擇(GEM,0.375μg/ml、3.75μg/ml、37.5μg/ml、375μg/ml、3750μg/ml、37500μg/ml)、ADM(0.015μg/ml、0.15μg/ml、1.5μg/ml、15μg/ml、150μg/ml)、絲裂霉素(MMC,0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml),每個藥物濃度設6個復孔;另設6個復孔不加藥物作為空白對照組。②化療聯(lián)合維拉帕米(Ver)組(簡稱聯(lián)合化療組),先加入終濃度為4.5μmol/L的Ver,1h后分別加入上述4種不同濃度梯度的化療藥物,每個藥物濃度設6個復孔;另設6個復孔只加入終濃度為4.5μmol/L的Ver作為對照。37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)48h。更換培養(yǎng)液,同時加入5mg/mlMTT20μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h,可見有不同程度的藍紫色(Formazo)結晶,加入二甲基亞砜100μl/孔,于酶標儀上振蕩3min,使結晶溶解,測波長570nm處吸光度(A)值。計算各組A值的平均值,以空白對照組的細胞生存率作為100%,用下列公式求出每種藥物濃度對細胞的抑制率:抑制率=1-加藥組A值對照組A值×100%=1?加藥組A值對照組A值×100%以藥物濃度的對數(shù)為橫坐標,以細胞抑制率為縱坐標繪制半對數(shù)曲線,SPSS軟件行直線回歸,計算50%抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)(RI):RΙ=耐藥細胞株ΙC50親本細胞株ΙC50RI=耐藥細胞株IC50親本細胞株IC501.5羅丹明和羅丹明法分別收集親本及耐藥胰腺癌細胞各1×106個/ml,1000r/min離心5min,棄上清,重懸于2ml1640培養(yǎng)液。實驗分兩組:單純羅丹明組(加入終濃度為0.15μg/ml的羅丹明)和羅丹明+Ver組(先加入終濃度為4.5μmol/L的Ver,1h后再加入終濃度為0.15μg/ml的羅丹明)。37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)30min。PBS洗滌細胞兩次,重懸于1640培養(yǎng)液中。37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)10min,1000r/min離心5min,重懸于0.5mlPBS液中,立即以FCM測定陽性細胞百分比。1.6n失活反應細胞總RNA提取參照TrizolReagent試劑盒說明書進行。①逆轉錄合成cDNA:將RNA稀釋為1μg/μl,在20μl反應體積中用5μg的RNA合成cDNA:42℃水浴50min,在70℃15min失活反應。②PCR擴增:PCR引物分別根據(jù)Genebank中人mdr1和β-actincDNA序列進行設計。mdr1上游引物:5′-ACTGAGCCTGGAGGTGAAGA-3′,下游引物:5′-CCACCAGAGAGCTGAGTTCC-3′;β-actin上游引物:5′-AACTGGGACATGGAGAAAATC-3′,下游引物:5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反應條件:95℃滅活5min,94℃變性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共35個循環(huán)。取5μlPCR產(chǎn)物,于含0.6%溴化乙啶的1.0%瓊脂糖凝膠,100V電壓條件下電泳。紫外燈下照相并分析。PCR產(chǎn)物長度為570bp。1.7統(tǒng)計處理SPSS軟件對實驗數(shù)據(jù)進行協(xié)方差分析,檢驗水準α=0.05。2結果2.1sw1929/adm在組織學上的改變經(jīng)過10個月的體外藥物培養(yǎng),我們得到穩(wěn)定傳代的耐藥細胞株,脫藥培養(yǎng)2個月后與親本細胞株SW1990相比,SW1990/ADM在形態(tài)學上發(fā)生了明顯的改變。光鏡下見細胞變圓、體積增大、胞漿內顆粒樣物質增多。電鏡下見細胞膜表面微絨毛增多,細胞膜表面積變大,胞漿細胞器數(shù)目增多,線粒體嵴紊亂、基質出現(xiàn)空泡;內質網(wǎng)擴張,胞漿內空泡結構增多(見圖1)。2.2細胞間腫瘤標記物檢測結果與親本細胞株SW1990相比,耐藥細胞株SW1990/ADM的倍增時間延長(P<0.05),G0/G1期比例增加,S期和G2/M期比例減少(P<0.05),但兩株細胞間腫瘤標記物檢測結果差異無顯著性意義(P>0.05),見表1。2.3adm和mmc的耐藥性MTT試驗結果顯示:與親本細胞株SW1990相比,耐藥細胞株SW1990/ADM對4種化療藥物均顯示出一定的耐藥性,尤以對ADM和MMC最為明顯。其中對ADM的耐藥指數(shù)高達49.60。細胞株對單純化療藥物的IC50值見表2;Ver可以部分逆轉其耐藥性(見表2)。2.4耐藥細胞系統(tǒng)的測定羅丹明外排實驗結果顯示,Ver阻斷前,親本細胞株SW1990和耐藥細胞株SW1990/ADM的陽性細胞百分比分別為58.3%和11.1%,兩組差異有顯著性意義(P<0.01),表明耐藥細胞株中P-gp的功能明顯強于親本細胞株;Ver阻斷后可將陽性細胞百分比分別增加至83.3%和37.3%,明顯高于阻斷前的比例,說明Ver可以部分逆轉耐藥細胞株的P-gp功能。2.5物的光密度比值細胞株多藥耐藥基因表達的結果以mdr1mRNA與β-actin的RT-PCR產(chǎn)物的光密度比值來表示(見圖2)。mdr1mRNA在SW1990和SW1990/ADM中的表達豐度分別為0.5750±0.0764和0.8921±0.0875(P<0.01),說明SW1990/ADM中mdr1mRNA表達明顯增高。3討論3.1胰腺p-gp表達Biedler等于1970年首先提出腫瘤多藥耐藥(MDR)這一概念,即腫瘤細胞對多種結構和功能不相關的化療藥物的交叉耐藥現(xiàn)象。近30年的基礎和臨床研究表明,大多數(shù)腫瘤的耐藥與多藥耐藥基因mdr1有關,其蛋白產(chǎn)物為P-gp,是一種細胞膜糖蛋白,具有能量依賴性藥泵的功能,能將多種抗癌藥物和其他疏水性化合物主動轉運出細胞外,使細胞內藥物濃度降低,最終導致細胞耐藥。雖然人們曾對胰腺癌是否表達P-gp有爭議,但近年來多數(shù)學者認為,胰腺癌存在內源性P-gp的表達,是一種先天性多藥耐藥腫瘤。Suwa等檢測了71例未經(jīng)化、放療的胰腺導管腺癌組織標本中mdr1基因的表達情況,發(fā)現(xiàn)所有胰腺導管腺癌組織中均有mdr1基因的表達,且明顯高于正常胰腺組織。我們的先期研究亦發(fā)現(xiàn),胰腺癌細胞株有mdr1表達,且其表達程度互不相同;進一步研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌細胞株對ADM和MMC的耐藥程度與多藥耐藥基因mdr1的表達成正相關性,且其耐藥性可被P-gp特異性逆轉劑Ver逆轉。3.2藥細胞株的制備方法Biedler等于70年代初首次通過體外化療藥物誘導建立了腫瘤多藥耐藥細胞株,為體外多藥耐藥機理研究提供了實驗模型,初步揭示了腫瘤耐藥機理。隨后,人們利用多種不同的化療藥物體外誘導建立了多種腫瘤耐藥細胞株,進一步加深了對其耐藥機理的了解。腫瘤耐藥細胞株建立的方法主要有基因轉染法和藥物篩選法。前者是將mdr1基因轉染敏感細胞株,獲得耐藥細胞株,此種耐藥表型的特點是耐藥基因型單純,但轉染率不高,且在轉染過程中容易因新基因的插入引起細胞性狀的改變;后者是用化療藥物間歇或持續(xù)作用腫瘤細胞后得到具有MDR表型的細胞株,這種誘導方式比較類似于臨床獲得性耐藥,是一種十分接近于腫瘤臨床化療后產(chǎn)生耐藥的方法,對于探討臨床腫瘤化療耐藥機理更有意義。研究表明,腫瘤耐藥細胞株誘導方式的不同可導致不同的耐藥機理。國內、外絕大多數(shù)耐藥細胞株的誘導方式與體內用藥特點相差甚遠。本研究考慮到臨床胰腺癌化療反復間歇用藥的特點,以SW1990細胞為實驗對象,采用大劑量反復間歇24h暴露法,歷時10個月,獲得了穩(wěn)定生長、耐藥指數(shù)較高的耐藥細胞株,為研究胰腺癌耐藥機理及篩選逆轉劑提供了理想的實驗模型。3.3耐藥基因檢測以往研究發(fā)現(xiàn),與親本細胞株比較,耐藥細胞株在形態(tài)、結構及代謝水平等方面均發(fā)生了顯著變化。本實驗建立的耐藥細胞株SW1990/ADM在無藥培養(yǎng)2個月后生長穩(wěn)定,倍增時間延長,細胞表面微絨毛增多,胞漿內出現(xiàn)大量空泡結構,我們推測這些生物學性狀的改變與其耐藥表型密切相關,但其詳細機理尚有待進一步研究。