人胰腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株sw950adm的建立及耐藥機(jī)理研究

人胰腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株sw950adm的建立及耐藥機(jī)理研究

多藥殘留基因mdr1是許多腫瘤化療失敗的原因之一。外瘤抗生素的形成對闡明腫瘤的抗藥機(jī)和篩選化療藥物具有重要的理論和實(shí)踐價值。我們的先期研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌細(xì)胞株SW1990的先天性耐藥與多藥耐藥基因mdr1的表達(dá)呈正相關(guān)性。在此基礎(chǔ)上,我們試圖通過建立胰腺癌耐藥細(xì)胞株,以進(jìn)一步探討其獲得性耐藥機(jī)理。1材料和方法1.1rt-pcr試劑阿霉素(ADM)等化療藥物由日本明治制藥有限公司出品;MTT為FIUKA公司產(chǎn)品;RT-PCR試劑購于美國Gibco公司;Rhodamine123(羅丹明)為美國Sigma公司產(chǎn)品;人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由解放軍總醫(yī)院腫瘤生物研究室提供使用。1.2細(xì)胞死亡情況觀察采用濃度梯度倍增法誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株SW1990/ADM。首先分別向生長有SW1990細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶內(nèi)加入不同濃度的ADM,培養(yǎng)1周后觀察細(xì)胞死亡情況。選擇可將80%的細(xì)胞殺死的藥物濃度(ID80)作為耐藥細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃度;然后將腫瘤細(xì)胞置于含有ID80藥物的培養(yǎng)液中培養(yǎng),24h后更換不含藥物的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞穩(wěn)定生長、進(jìn)入對數(shù)生長期后,傳代兩次,再將細(xì)胞株于加倍劑量(2×ID80)的ADM中繼續(xù)培養(yǎng);依此類推,共經(jīng)過9個濃度梯度、約10個月的培養(yǎng),最后脫藥培養(yǎng)2個月后備用。1.3sw1990對adm菌的生物學(xué)特性的檢測1.3.1社會學(xué)觀察將兩株細(xì)胞分別爬片后經(jīng)HE染色,光鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;再分別收集兩株細(xì)胞,固定后電鏡下行超微結(jié)構(gòu)觀察。1.3.2通過微分時間測定和微細(xì)胞周期分析細(xì)胞培養(yǎng)和復(fù)孔觀察取對數(shù)生長期的親本及耐藥細(xì)胞各一瓶,0.25%胰酶消化,10%小牛血清-1640培養(yǎng)液制成濃度為1×104個/ml的單細(xì)胞懸液,24孔板中每孔接種1ml,37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個復(fù)孔計數(shù)活細(xì)胞,計算平均值,連續(xù)觀察7d。以培養(yǎng)時間為橫軸,以細(xì)胞數(shù)的對數(shù)為縱軸,繪制半對數(shù)細(xì)胞生長曲線,于生長曲線上對數(shù)生長期內(nèi)取3組數(shù)據(jù),根據(jù)最小二乘法進(jìn)行直線回歸,在直線上任取兩點(diǎn)(N、N0),根據(jù)下列公式計算細(xì)胞的倍增時間(dt)(式中t代表N0～N的時間):dt=0.693tlgΝΝ0dt=0.693tlgNN02.細(xì)胞周期分析取對數(shù)生長期的親本及耐藥細(xì)胞各1×106個/ml,制成單細(xì)胞懸液,按試劑盒說明進(jìn)行操作,于流式細(xì)胞儀(FCM)上行細(xì)胞周期分析。1.3.3cea及ca19-9對cea、ca19-9、cea、ca19-9細(xì)胞培養(yǎng)液的制備分別將同等數(shù)量的親本及耐藥細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi),37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng),待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期后,分別收集培養(yǎng)液各10ml,1000r/min離心5min后取上清,行CEA及CA19-9的檢測。1.4化療藥物的復(fù)孔、化療聯(lián)合拉米、mmc的制備收集親本及耐藥胰腺癌細(xì)胞株,分別制成濃度為5×104個/ml的單細(xì)胞懸液,接種于96孔板,每孔200μl。實(shí)驗(yàn)分兩組:①單純化療組,分別加入4種不同濃度梯度的化療藥物,即氟尿嘧啶(5-FU,0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml、5000μg/ml)、健擇(GEM,0.375μg/ml、3.75μg/ml、37.5μg/ml、375μg/ml、3750μg/ml、37500μg/ml)、ADM(0.015μg/ml、0.15μg/ml、1.5μg/ml、15μg/ml、150μg/ml)、絲裂霉素(MMC,0.005μg/ml、0.05μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml、50μg/ml、500μg/ml),每個藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔;另設(shè)6個復(fù)孔不加藥物作為空白對照組。②化療聯(lián)合維拉帕米(Ver)組(簡稱聯(lián)合化療組),先加入終濃度為4.5μmol/L的Ver,1h后分別加入上述4種不同濃度梯度的化療藥物,每個藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔;另設(shè)6個復(fù)孔只加入終濃度為4.5μmol/L的Ver作為對照。37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)48h。更換培養(yǎng)液,同時加入5mg/mlMTT20μl/孔,繼續(xù)培養(yǎng)4h,可見有不同程度的藍(lán)紫色(Formazo)結(jié)晶,加入二甲基亞砜100μl/孔,于酶標(biāo)儀上振蕩3min,使結(jié)晶溶解,測波長570nm處吸光度(A)值。計算各組A值的平均值,以空白對照組的細(xì)胞生存率作為100%,用下列公式求出每種藥物濃度對細(xì)胞的抑制率:抑制率=1-加藥組A值對照組A值×100%=1?加藥組A值對照組A值×100%以藥物濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo),以細(xì)胞抑制率為縱坐標(biāo)繪制半對數(shù)曲線,SPSS軟件行直線回歸,計算50%抑制濃度(IC50)及耐藥指數(shù)(RI):RΙ=耐藥細(xì)胞株ΙC50親本細(xì)胞株ΙC50RI=耐藥細(xì)胞株IC50親本細(xì)胞株IC501.5羅丹明和羅丹明法分別收集親本及耐藥胰腺癌細(xì)胞各1×106個/ml,1000r/min離心5min,棄上清,重懸于2ml1640培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)分兩組:單純羅丹明組(加入終濃度為0.15μg/ml的羅丹明)和羅丹明+Ver組(先加入終濃度為4.5μmol/L的Ver,1h后再加入終濃度為0.15μg/ml的羅丹明)。37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)30min。PBS洗滌細(xì)胞兩次,重懸于1640培養(yǎng)液中。37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)10min,1000r/min離心5min,重懸于0.5mlPBS液中,立即以FCM測定陽性細(xì)胞百分比。1.6n失活反應(yīng)細(xì)胞總RNA提取參照TrizolReagent試劑盒說明書進(jìn)行。①逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA:將RNA稀釋為1μg/μl,在20μl反應(yīng)體積中用5μg的RNA合成cDNA:42℃水浴50min,在70℃15min失活反應(yīng)。②PCR擴(kuò)增:PCR引物分別根據(jù)Genebank中人mdr1和β-actincDNA序列進(jìn)行設(shè)計。mdr1上游引物:5′-ACTGAGCCTGGAGGTGAAGA-3′,下游引物:5′-CCACCAGAGAGCTGAGTTCC-3′;β-actin上游引物:5′-AACTGGGACATGGAGAAAATC-3′,下游引物:5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反應(yīng)條件:95℃滅活5min,94℃變性30s,65℃退火30s,72℃延伸1min,共35個循環(huán)。取5μlPCR產(chǎn)物,于含0.6%溴化乙啶的1.0%瓊脂糖凝膠,100V電壓條件下電泳。紫外燈下照相并分析。PCR產(chǎn)物長度為570bp。1.7統(tǒng)計處理SPSS軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行協(xié)方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1sw1929/adm在組織學(xué)上的改變經(jīng)過10個月的體外藥物培養(yǎng),我們得到穩(wěn)定傳代的耐藥細(xì)胞株,脫藥培養(yǎng)2個月后與親本細(xì)胞株SW1990相比,SW1990/ADM在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了明顯的改變。光鏡下見細(xì)胞變圓、體積增大、胞漿內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多。電鏡下見細(xì)胞膜表面微絨毛增多,細(xì)胞膜表面積變大,胞漿細(xì)胞器數(shù)目增多,線粒體嵴紊亂、基質(zhì)出現(xiàn)空泡;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,胞漿內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)增多(見圖1)。2.2細(xì)胞間腫瘤標(biāo)記物檢測結(jié)果與親本細(xì)胞株SW1990相比,耐藥細(xì)胞株SW1990/ADM的倍增時間延長(P<0.05),G0/G1期比例增加,S期和G2/M期比例減少(P<0.05),但兩株細(xì)胞間腫瘤標(biāo)記物檢測結(jié)果差異無顯著性意義(P>0.05),見表1。2.3adm和mmc的耐藥性MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示:與親本細(xì)胞株SW1990相比,耐藥細(xì)胞株SW1990/ADM對4種化療藥物均顯示出一定的耐藥性,尤以對ADM和MMC最為明顯。其中對ADM的耐藥指數(shù)高達(dá)49.60。細(xì)胞株對單純化療藥物的IC50值見表2;Ver可以部分逆轉(zhuǎn)其耐藥性(見表2)。2.4耐藥細(xì)胞系統(tǒng)的測定羅丹明外排實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Ver阻斷前,親本細(xì)胞株SW1990和耐藥細(xì)胞株SW1990/ADM的陽性細(xì)胞百分比分別為58.3%和11.1%,兩組差異有顯著性意義(P<0.01),表明耐藥細(xì)胞株中P-gp的功能明顯強(qiáng)于親本細(xì)胞株;Ver阻斷后可將陽性細(xì)胞百分比分別增加至83.3%和37.3%,明顯高于阻斷前的比例,說明Ver可以部分逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞株的P-gp功能。2.5物的光密度比值細(xì)胞株多藥耐藥基因表達(dá)的結(jié)果以mdr1mRNA與β-actin的RT-PCR產(chǎn)物的光密度比值來表示(見圖2)。mdr1mRNA在SW1990和SW1990/ADM中的表達(dá)豐度分別為0.5750±0.0764和0.8921±0.0875(P<0.01),說明SW1990/ADM中mdr1mRNA表達(dá)明顯增高。3討論3.1胰腺p-gp表達(dá)Biedler等于1970年首先提出腫瘤多藥耐藥(MDR)這一概念,即腫瘤細(xì)胞對多種結(jié)構(gòu)和功能不相關(guān)的化療藥物的交叉耐藥現(xiàn)象。近30年的基礎(chǔ)和臨床研究表明,大多數(shù)腫瘤的耐藥與多藥耐藥基因mdr1有關(guān),其蛋白產(chǎn)物為P-gp,是一種細(xì)胞膜糖蛋白,具有能量依賴性藥泵的功能,能將多種抗癌藥物和其他疏水性化合物主動轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外,使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低,最終導(dǎo)致細(xì)胞耐藥。雖然人們曾對胰腺癌是否表達(dá)P-gp有爭議,但近年來多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,胰腺癌存在內(nèi)源性P-gp的表達(dá),是一種先天性多藥耐藥腫瘤。Suwa等檢測了71例未經(jīng)化、放療的胰腺導(dǎo)管腺癌組織標(biāo)本中mdr1基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)所有胰腺導(dǎo)管腺癌組織中均有mdr1基因的表達(dá),且明顯高于正常胰腺組織。我們的先期研究亦發(fā)現(xiàn),胰腺癌細(xì)胞株有mdr1表達(dá),且其表達(dá)程度互不相同;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌細(xì)胞株對ADM和MMC的耐藥程度與多藥耐藥基因mdr1的表達(dá)成正相關(guān)性,且其耐藥性可被P-gp特異性逆轉(zhuǎn)劑Ver逆轉(zhuǎn)。3.2藥細(xì)胞株的制備方法Biedler等于70年代初首次通過體外化療藥物誘導(dǎo)建立了腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株,為體外多藥耐藥機(jī)理研究提供了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?初步揭示了腫瘤耐藥機(jī)理。隨后,人們利用多種不同的化療藥物體外誘導(dǎo)建立了多種腫瘤耐藥細(xì)胞株,進(jìn)一步加深了對其耐藥機(jī)理的了解。腫瘤耐藥細(xì)胞株建立的方法主要有基因轉(zhuǎn)染法和藥物篩選法。前者是將mdr1基因轉(zhuǎn)染敏感細(xì)胞株,獲得耐藥細(xì)胞株,此種耐藥表型的特點(diǎn)是耐藥基因型單純,但轉(zhuǎn)染率不高,且在轉(zhuǎn)染過程中容易因新基因的插入引起細(xì)胞性狀的改變;后者是用化療藥物間歇或持續(xù)作用腫瘤細(xì)胞后得到具有MDR表型的細(xì)胞株,這種誘導(dǎo)方式比較類似于臨床獲得性耐藥,是一種十分接近于腫瘤臨床化療后產(chǎn)生耐藥的方法,對于探討臨床腫瘤化療耐藥機(jī)理更有意義。研究表明,腫瘤耐藥細(xì)胞株誘導(dǎo)方式的不同可導(dǎo)致不同的耐藥機(jī)理。國內(nèi)、外絕大多數(shù)耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)方式與體內(nèi)用藥特點(diǎn)相差甚遠(yuǎn)。本研究考慮到臨床胰腺癌化療反復(fù)間歇用藥的特點(diǎn),以SW1990細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象,采用大劑量反復(fù)間歇24h暴露法,歷時10個月,獲得了穩(wěn)定生長、耐藥指數(shù)較高的耐藥細(xì)胞株,為研究胰腺癌耐藥機(jī)理及篩選逆轉(zhuǎn)劑提供了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.3耐藥基因檢測以往研究發(fā)現(xiàn),與親本細(xì)胞株比較,耐藥細(xì)胞株在形態(tài)、結(jié)構(gòu)及代謝水平等方面均發(fā)生了顯著變化。本實(shí)驗(yàn)建立的耐藥細(xì)胞株SW1990/ADM在無藥培養(yǎng)2個月后生長穩(wěn)定,倍增時間延長,細(xì)胞表面微絨毛增多,胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量空泡結(jié)構(gòu),我們推測這些生物學(xué)性狀的改變與其耐藥表型密切相關(guān),但其詳細(xì)機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。