溶藻弧菌分離及其耐藥性研究

溶藻弧菌分離及其耐藥性研究

溶藻弧菌（va）屬于嗜鹽細(xì)菌和嗜鹽菌，廣泛分布于世界各地的海水和河流入?？?。這是中國海洋的主要優(yōu)勢細(xì)菌。該菌是水生動物的主要致病菌,可通過受損的魚類皮膚和口腔而引發(fā)感染,并可導(dǎo)致人類的多種疾病,包括皮膚表面?zhèn)诟腥竞蜐?、蜂窩組織炎、壞死性筋膜炎,耳部中耳炎和外耳炎,眼部結(jié)膜炎、骨髓炎、腦膜炎以及敗血癥等,近年來的研究證實(shí),該菌與副溶血弧菌一樣,是沿海地區(qū)腹瀉病和食物中的常見病原菌?？股卦跐O業(yè)的大量使用會使病原菌對藥物的敏感性下降甚至消失,增加了病害的防治難度,并且對抗生素的耐藥的食源性細(xì)菌可以通過食物鏈傳遞給人類,同時也可能將耐藥基因轉(zhuǎn)移給其他致病菌和環(huán)境菌株。國內(nèi)外關(guān)于溶藻弧菌耐藥性的研究主要的研究對象是食物中毒菌株和臨床分離菌株,而對于環(huán)境中溶藻弧菌的耐藥性研究相對較少。本實(shí)驗(yàn)在食物中毒高發(fā)的夏季,在上海臨港海域近海水中分離出33株溶藻弧菌,并對分離菌株進(jìn)行了20種常見抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn),旨在了解上海臨港海域的溶藻弧菌分布及其耐藥性情況,并為人類臨床和獸醫(yī)用藥及進(jìn)行食源性疾病控制提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料和試劑溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749上海復(fù)祥生物公司;大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922獲贈于上海出入境檢驗(yàn)檢疫局;樣品100份樣品均在2012年6~9月采集于上海臨港地區(qū),使用無菌采樣器采集水下10~20cm深處海水,并于3h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理;細(xì)菌學(xué)蛋白胨、硫檸膽蔗瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)及胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)上海市浦東新區(qū)疾病預(yù)防控制中心;科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基(CV)上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司;PCR反應(yīng)試劑盒及所用引物等生工生物(上海)有限公司;MH(MuellerHintonAgar)瓊脂培養(yǎng)基及20種抗生素藥敏試紙片杭州天和微生物試劑有限公司。ClassIIBSC生物安全柜新加坡ESCO公司;PTC-200PCR儀及GelDocXR凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-Rad公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1溶藻弧菌的分離培養(yǎng)所有樣品均使用含30g/LNaCl的堿性蛋白胨水,37℃,120r/min振蕩培養(yǎng)18~24h,用接種環(huán)挑取培養(yǎng)液于TCBS平板劃線,于37℃培養(yǎng)18~24h。挑取TCBS上的圓潤黏稠的黃色單菌落純化2~3次后,接種于CV培養(yǎng)基平板,于37℃培養(yǎng)18~24h,觀察菌落特征,溶藻弧菌在CV培養(yǎng)基上的典型菌落為透明或半透明、光滑濕潤的白色菌落。挑取疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色、10%NaCl嗜鹽性生長實(shí)驗(yàn)和鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初篩,實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn),并以溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749作對照。1.2.2rt-pcr擴(kuò)增溶藻弧菌及擴(kuò)增條件初篩后的菌株接種于含3%NaCl的TSB液體培養(yǎng)基中于37℃,120r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h。采用水煮法提取DNA:取純培養(yǎng)物1mL于10000r/min離心5min,棄上清,用500μL無菌生理鹽水懸浮菌體,置于干式恒溫儀100℃保持10min,0℃保持10min,10000r/min離心3min,取上清液儲存在-20℃?zhèn)溆谩SP60是溶藻弧菌的特征基因,在GenBank中登錄號為AY332570,若分離菌株經(jīng)PCR可擴(kuò)增出560bp的條帶,則判定為溶藻弧菌。其上下游引物序列分別為:P1:5’ACAACAGCAACGGTACTAGC3’和P2:5’CAACTTTCACGATGCCAC3’,反應(yīng)體系20μL:2×PCRMaster10μL、ddH2O7μL、DNA模板1μL、上下游引物各1μL。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性6min;94℃變性30s,55℃退火35s,72℃延伸1min,30個循環(huán);72℃再延伸10min,4℃冷卻。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用100V電壓,1%瓊脂糖凝膠電泳40min。1.2.3抗菌活性的測定采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法(Kirby-Bauer)測定分離菌株對20種抗生素的敏感性。分別挑取在TCBS上培養(yǎng)18~24h的各菌株單菌落于含3%NaCl的TSB培養(yǎng)基中37℃、120r/min振蕩培養(yǎng)6~8h,用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?OD625=0.08~0.13)。取200μL菌液至直徑為90mm的無菌平皿中,定量加入滅菌后冷卻至46℃左右的MH瓊脂培養(yǎng)基25mL(含1%NaCl),充分混勻,靜置20~30min后貼藥敏試紙片。每種抗生素貼2個藥敏試紙片,每個平板貼5片。(35±1)℃培養(yǎng)16~18h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈,實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀參照文獻(xiàn),以大腸桿菌ATCC25922為參考菌株進(jìn)行質(zhì)控。20種抗生素的含量及耐藥折點(diǎn)見表1。2結(jié)果與分析2.1菌落的選擇100份海水樣品增菌液中有42份在TCBS平板獲得黃色菌落,將其純化并轉(zhuǎn)接到CV培養(yǎng)基中,得到透明或半透明、邊緣光滑、表面濕潤的白色菌落33份。將33株疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色、10%NaCl嗜鹽性生長和ONPG實(shí)驗(yàn)三種生化指標(biāo)的鑒定,結(jié)果均為革蘭氏陰性短桿菌,能夠在含10%NaCl的堿性蛋白胨中生長和ONPG陰性,與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17749的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。2.2溶藻弧菌特異性基因檢測提取33株疑似菌株的DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),電泳圖譜顯示所有菌株均在560bp出現(xiàn)條帶,即擴(kuò)增出溶藻弧菌特異性基因HSP60。部分溶藻弧菌的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。2.3溶藻弧菌對20種抗菌藥的耐藥性33株溶藻弧菌對抗生素均存在不同的耐藥性(見表2),其中DH030對羧芐青霉素、氨芐青霉素、頭孢噻吩、頭孢哌酮、氨芐青霉素/舒巴坦、慶大霉素、丁胺卡那霉素、四環(huán)素、萬古霉素、多粘菌素B和痢特靈共11種抗生素具有耐藥性,其耐藥率高達(dá)55.0%;DH024對羧芐青霉素、萬古霉素和利福平具有耐藥性,DH031對羧芐青霉素、氨芐青霉素和萬古霉素具有耐藥性,耐藥率均為15.0%。其他菌株對20種抗生素的耐藥率在20.0%~50.0%之間。比較33株溶藻弧菌對20種抗生素的耐藥性(見圖2),可以得到如下結(jié)論:溶藻弧菌對氨芐青霉素、羧芐青霉素和萬古霉素有很高的耐藥性;對頭孢吡肟、安曲南、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素及氯霉素均100.0%敏感;溶藻弧菌對頭孢1到4代的耐藥率雖不是持續(xù)降低,但對其藥物敏感性不斷增高;溶藻弧菌對同類抗生素的耐藥性也有很大不同,如氨基糖苷類的慶大霉素和丁胺卡那霉素,耐藥率分別為15.2%和72.7%;溶藻弧菌對某些抗生素雖然耐藥率不高,但也不敏感,處于中介敏感范圍,如頭孢噻吩、頭孢呋辛和復(fù)方新諾明。本次分離的溶藻弧菌均至少對3種及3種以上抗生素多重耐藥(見表3),同時對6種及6種以上抗生素耐藥的有15株,占總數(shù)的45.5%,同時對8種及8種以上抗生素耐藥的有6株,占總數(shù)的18.2%。3k-b擴(kuò)散法藥敏實(shí)驗(yàn)溶藻弧菌會分解TCBS平板中的蔗糖,使其菌落呈黃色,但培養(yǎng)時間超過24h后,部分菌落會變成綠色,這是由于培養(yǎng)基中的蔗糖被消耗完全所造成的,因此在使用TCBS培養(yǎng)基對溶藻弧菌進(jìn)行分離時,應(yīng)選擇在37℃生長24h內(nèi)的典型菌落。同樣能夠在TCBS平板上形成黃色菌落的弧菌還包括霍亂弧菌、鰻弧菌等,但通過CV培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、10%嗜鹽性實(shí)驗(yàn)和ONPG實(shí)驗(yàn)基本可以排除。因此,在對溶藻弧菌進(jìn)行分離鑒定時,可先用TCBS和CV平板進(jìn)行選擇性分離,再用革蘭氏染色、10%嗜鹽性實(shí)驗(yàn)和ONPG實(shí)驗(yàn)這三種重要的生理生化指標(biāo)進(jìn)行初步篩選,最后采用分子生物學(xué)方法驗(yàn)證,可在保證分離的準(zhǔn)確性的同時減少鑒定的工作量。K-B擴(kuò)散法是一種經(jīng)典的藥敏實(shí)驗(yàn)方法,到目前為止,CLSI的推薦方法仍然為用無菌棉拭子蘸取0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?擠壓棉拭子上的多余菌液后在MH平板上進(jìn)行涂布。但細(xì)菌的接種量仍然受到棉拭子大小和操作人員對棉拭子的擠壓程度的影響。在使用培養(yǎng)基、藥敏試紙片的質(zhì)量和藥物含量、培養(yǎng)時間相同的條件下,細(xì)菌的接種量越大,抑菌圈越小。為消除接種量對藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,本研究在經(jīng)過質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922對抗生素的藥敏實(shí)驗(yàn)后,確認(rèn)了本次采用200μL的0.5麥?zhǔn)蠞舛染鷳乙憾拷臃N后傾注培養(yǎng)基的方法能使抑菌圈具有窄的分布范圍和更好的重復(fù)性。本研究從100份海水樣品中共分離得到33株溶藻弧菌,檢出率為33.0%,并且所有分離菌株均表現(xiàn)出多重耐藥性(多重耐藥率為15.0%~55.0%),提示我們在食用海產(chǎn)品或海產(chǎn)品加工過程中需采取有效的滅菌措施,防止食源性致病菌引起的食物中毒、阻止耐藥菌株在腸道中將耐藥基因轉(zhuǎn)移給致病性更強(qiáng)的細(xì)菌。在20種抗生素中,溶藻弧菌分離菌株對羧芐青霉素、氨芐青霉素和萬古霉素的耐藥性較高,對頭孢吡肟、安曲南、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、紅霉素及氯霉素均表現(xiàn)敏感。但不同地點(diǎn)和時間分離的溶藻弧菌耐藥譜具有很大差異[19,20,21,22,23,24,25],因此有必要對各地的溶藻弧菌耐藥譜進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控,從而選擇合適的藥物來進(jìn)行對其引起疾病的防控。近年來我國的食品安全問題愈發(fā)突出,食源性致病菌的耐藥性對食品安全及人類身體健康的影響已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生一方面是因?yàn)榭股氐膹V泛使用提供了細(xì)菌的耐藥突變形成了選擇性壓力,使耐