空間單細(xì)胞蛋白組常見問題與答案

1.PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）技術(shù)如何運行？其原理是什么？這個系統(tǒng)由三個部分組成，包括：1、試劑。試劑中包含對目標(biāo)蛋白或者目標(biāo)mRNA進(jìn)行結(jié)合的抗體和熒光報告探針，以及相關(guān)的試劑、耗材；對于每一個要檢測的目標(biāo)蛋白，用一個針對這個目標(biāo)蛋白的抗體，偶連上一段有特定barcode序列的DNA標(biāo)簽鏈?？贵w部分負(fù)責(zé)識別目標(biāo)蛋白，barcode標(biāo)簽的DNA序列可以與報告探針的DNA鏈相互補從而被報告探針Reporters所識別。2、儀器。包括成像系統(tǒng)和雜交、清洗的液流系統(tǒng)；3、分析軟件。軟件可以把儀器獲得的圖像信息轉(zhuǎn)變成單細(xì)胞的空間組學(xué)信息，從而進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)分析。具體的流程為：第一步，把檢測的抗體panel與切片進(jìn)行孵育。孵育的過程中抗體就會結(jié)合到相應(yīng)的抗原上；第二步，開始進(jìn)行第一輪的雜交顯色。加入第一組3個熒光報告探針進(jìn)行雜交，這3個探針針對3個不同的蛋白上結(jié)合的抗體，并且這3個探針分別發(fā)出不同顏色的熒光。雜交好之后，用顯微鏡對切片進(jìn)行拍照成像。接下來，把第一輪結(jié)合上的報告探針洗掉。在這一輪的雜交中，檢測到了3種蛋白。然后進(jìn)入第二輪的雜交顯色。加入第二組的3個熒報告探針。把雜交、拍照、洗脫的這個過程重復(fù)再做一遍。檢測到第二輪的另外3種蛋白。再接著，做三輪、第四輪，第N輪的雜交顯色。這樣，經(jīng)過多輪的雜交顯色，就可以把一個panel中所針對的全部蛋白都檢測到。注：熒光檢測的通道有4種：分別為647，550，750和488通道，其中石蠟切片的自發(fā)熒光比較強，尤其是488通道，所以石蠟樣本不用488通道，只用于冰凍切片。2.細(xì)胞鄰域作為PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）技術(shù)的一個新穎的亮點，為什么要做空間鄰域的分析？它是如何發(fā)現(xiàn)（定義）的？技術(shù)和算法的進(jìn)步允許我們識別新的空間關(guān)系，但確定其中哪些是組織行為的信息仍然具有最高的臨床效用和挑戰(zhàn)性，如免疫腫瘤微環(huán)境（iTME）是腫瘤、免疫、基質(zhì)和細(xì)胞外成分的復(fù)雜組合，這些成分在細(xì)胞和組織空間水平上在抗腫瘤免疫中起著至關(guān)重要的作用。因此，基于組織內(nèi)細(xì)胞類型的空間排列預(yù)測細(xì)胞-細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)（即what-where-how）正是其研究的價值所在。細(xì)胞鄰域的構(gòu)建，即1.對于數(shù)據(jù)集中的每個細(xì)胞，使用其源組織內(nèi)細(xì)胞的距離圖來識別由索引細(xì)胞及其10個最近鄰居組成的生態(tài)位（niche）或windows，識別鄰居細(xì)胞的類型身份以揭示每個細(xì)胞的生態(tài)位組成。2.所有的這些window根據(jù)“窗口”中每種細(xì)胞類型的比例進(jìn)行非監(jiān)督聚類到clusters中。3.聚類后得到的組織類群根據(jù)細(xì)胞的X坐標(biāo)和Y坐標(biāo)信息進(jìn)行模擬，展示為計算的細(xì)胞鄰域在組織切片上的空間分布圖?？勺鳛樾滦偷纳飿?biāo)志物為疾病治療提供新見解。注：為了對每種細(xì)胞類型的豐度差異進(jìn)行歸—化，對生態(tài)位組成niche進(jìn)行了分位數(shù)歸—化，并且成對相互作用的富集顯示為給定細(xì)胞類型的所有細(xì)胞生態(tài)位的均值分位數(shù)。3.PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）對不同組織的樣本的要求是怎樣的？包括樣本的大小尺寸以及年限？以及適用的物種有哪些？使用防脫片處理的載玻片，組織切片應(yīng)完全粘在載玻片上，沒有褶皺或撕裂。為確保組織切片不被損壞，關(guān)鍵是不要將組織切片堆疊在一起。對于樣本的尺寸，厚度可盡量在4~10μm，成像面積大小為18*35mm，分辨率高達(dá)0.25μm/像素；樣本量需求對于樣本年限，石蠟樣本是否可用的評定標(biāo)準(zhǔn)主要根據(jù)免疫組化實驗的可行性進(jìn)行判斷，新鮮冰凍的切片樣本一般半年以內(nèi)可用；適用的物種，人類中已有文獻(xiàn)對多個不同部位的組織樣本的應(yīng)用案例研究，目前已驗證的DNA偶聯(lián)抗體具有72種，對于其他的樣本如軟骨組織需要脫鈣處理，目前的應(yīng)用案例沒顯示會影響蛋白的鑒定。小鼠中有25種在冰凍切片樣本中已被驗證切實可行（石蠟樣本正在驗證中）。需要注意的是，目前大部分抗體不具有物種通用性，且小鼠的石蠟樣本目前尚在驗證。因此，對于非商業(yè)化的抗體如果想要嘗試該技術(shù)流程，可以進(jìn)行抗體偶聯(lián)測試，但還是建議使用商業(yè)化抗體和冰凍樣本。

4.細(xì)胞鄰域分析作為PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）技術(shù)分析的一大特色板塊，對于細(xì)胞類型少的組織樣本諸如血管組織細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等是否也可以做細(xì)胞鄰域的分析呢？可以，發(fā)現(xiàn)或者定義細(xì)胞鄰域的過程中事實上是沒有對細(xì)胞類型加以區(qū)分，主要依據(jù)的是非監(jiān)督分類對組織細(xì)胞進(jìn)行聚類來定義的。5.PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）技術(shù)的優(yōu)勢如何？快速，10分鐘成像100萬細(xì)胞；高通量，單周可以實現(xiàn)5-100張以上樣本拍攝；高參數(shù)，單個樣本同時進(jìn)行100+蛋白標(biāo)志物檢測；單細(xì)胞分辨率，高達(dá)0.25μm/像素（一般細(xì)胞在20~30μm大小，亞細(xì)胞分辨率小于10μm），可以任意組合并展示需要觀察的蛋白；而根據(jù)細(xì)胞核染色進(jìn)行的單細(xì)胞分割可以獲得每個細(xì)胞完整的形態(tài)、空間位置、蛋白質(zhì)組表達(dá)水平信息等數(shù)據(jù)揭示功能性空間生物學(xué)特征；這種單細(xì)胞水平上的全片組織成像分析，對于一些稀有且在組織中占比較小的細(xì)胞也可以檢測到；空間多組學(xué)，同時支持蛋白和RNA組織原位檢測（尚未投入使用），可以結(jié)合其他組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行更全面的研究；超多重空間表型和功能分析，通過對全組織整張樣本圖像的無偏差記錄允許我們可以任選區(qū)域、任意marker組合進(jìn)行分析，檢測不同部位、多種細(xì)胞類型，進(jìn)行空間表型分析和細(xì)胞空間關(guān)系分析。6.PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）技術(shù)如果要定制的4個抗體，有3個647和1個550，這樣是否可行？如何開展實驗？時間上會由于減少檢測的指標(biāo)而縮短嗎？如果一定要檢測這個蛋白指標(biāo)的話也可以上機測試，實驗時設(shè)置的每個cycle檢測蛋白指標(biāo)并不是每次都用滿3個reporter。實驗開展根據(jù)原理，可以分為3個循環(huán)來完成，其中一輪循環(huán)檢測兩個目標(biāo)蛋白，另外兩輪循環(huán)各檢測一種目標(biāo)蛋白；每個cycle用時包括添加reporter孵育的時間，掃描成像的時間以及洗脫reporter的時間，整體的用時更多的跟組織樣本的大小有關(guān)。7.如果兩個樣本中每個細(xì)胞鄰域內(nèi)不同細(xì)胞亞型的富集比例不同，或者同一個細(xì)胞鄰域在兩種疾病之間其數(shù)量和細(xì)胞數(shù)目都不一樣，這種情況下PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）怎么比較？對于同一種細(xì)胞鄰域，基本上主要的細(xì)胞成分是一致的。不同樣本間的比較，可以統(tǒng)計每一種細(xì)胞領(lǐng)域的在整個樣本占比是多少，細(xì)胞鄰域和鄰域之間怎么樣分布的，是否存在樣本間差異。8.單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)如何與PCF空間單細(xì)胞蛋白組（原Codex）技術(shù)相關(guān)聯(lián)并提升文章的檔次？scRNA-seq要求細(xì)胞完整的從組織中回收并存活，很多研究不能進(jìn)行多種細(xì)胞類型的研究，同時在很大程度上破壞了細(xì)胞的空間背景，不能為細(xì)胞的身份和功能分析提供信息。PCF空間單細(xì)胞蛋白組分析可使得組織內(nèi)各種細(xì)胞的分布情況可視化，彌補了單細(xì)胞測序在原位信息呈現(xiàn)上的不足，如流式或CyTOF只是對表型比例的驗證，無法獲得細(xì)胞空間位置上的驗證，以及多重免疫染色不是對單細(xì)胞水平的驗證，可檢測的指標(biāo)也少，因而PCF技術(shù)則可以同時解決以上兩個缺點更精確、全面的展示組織上細(xì)胞間的空間關(guān)系。9.不同類型和規(guī)格的組織芯片是否可用于PCF空間單細(xì)胞蛋白組？可以，各種規(guī)格的組織芯片只要都是在成像范圍內(nèi)貼片都可以使用。注：石蠟包埋組織芯片的局限性在于不能同時檢測DNA、mRNA及蛋白質(zhì)的改變，因為三者最佳固定條件不同，冷凍組織芯片