牛子及其提取物對(duì)糖尿病大鼠腎臟gf-

牛子及其提取物對(duì)糖尿病大鼠腎臟gf-

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，中國(guó)糖尿病患者往往逐年增加。中國(guó)是世界上人口最多的國(guó)家之一，絕對(duì)人數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)西方國(guó)家。糖尿病性腎炎（dn）是糖尿病最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。據(jù)許多歐洲和美國(guó)國(guó)家統(tǒng)計(jì)，由于dn，aig在末期（esr）下需要進(jìn)行透析治療的患者數(shù)量達(dá)到esr患者的35%。不久的將來(lái),糖尿病腎病在我國(guó)必將成為導(dǎo)致終末期腎衰的最主要原因之一。我的導(dǎo)師陳以平教授在繼承傳統(tǒng)中醫(yī)的精華的基礎(chǔ)上,結(jié)合個(gè)人豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),提出用復(fù)方牛蒡子合劑治療糖尿病腎病,并且已應(yīng)用于臨床,取得了良好的治療效果。既往的研究已證實(shí),復(fù)方牛蒡子合劑可改善糖尿病大鼠的腎臟病理改變,為了明確其主藥牛蒡子對(duì)糖尿病腎損害的作用機(jī)制,我們針對(duì)單味藥牛蒡子,以其對(duì)大鼠腎皮質(zhì)TGF-β1和MCP-1mRNA表達(dá)的影響為依據(jù),進(jìn)行了一部分實(shí)驗(yàn)研究。1材料與方法儀器設(shè)備RNA/DNA定量檢測(cè)儀:Pharmacia公司。PCR儀:PE公司。電泳儀及水平式電泳槽:Bio-Rad公司。凝膠數(shù)碼成像儀及圖像分析系統(tǒng):AlphaInnotech公司。光學(xué)顯微鏡及攝像系統(tǒng):Nicon公司。PCR引物合成檢測(cè)大鼠TGF-β1的上游引物:TGF-UP:5’-CGAGGTGACCTGGGCACCATCCATGAC-3’;TGFβ1的下游引物:TGF-Down:5’-CTGCTCCACCTTCTTGGGCTTGCGACCCAC-3’;檢測(cè)大鼠MCP-1上游引物:MCP-1-UP:5’-ATGCAGGTCTCTGTCACG-3’,MCP-1下游引物:MCP-1-Down:5’-CTAGTTCTCTGTCATACT-5’。檢測(cè)大鼠β-Actin的內(nèi)參引物:上游β-Actin-UP:5’-TGGGACGATATGGAGAAGAT;下游引物:β-Actin-Down:5’-ATTGCCGATAGTGATGACCT。(引物由上海博彩公司合成,引物用無(wú)菌水配制成50mM儲(chǔ)存)。主要試劑(1)造模用試劑:鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ),Sigma公司。(2)分子生物學(xué)試劑:異硫氰酸胍:Gibco公司。SuperScriptⅡ(SSⅡ)逆轉(zhuǎn)錄酶:Gibco公司。Oligo(dT):Promega公司。dNTPs(四種各100mM):Promega公司。TaqDNA聚合酶:Biostar公司及華美生物工程公司。2實(shí)驗(yàn)方法動(dòng)物飼養(yǎng)大鼠飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物室。實(shí)驗(yàn)期間,動(dòng)物室溫度控制在21~25℃,12h交替照明。大鼠自由飲水、進(jìn)食,保持墊料干燥,每天換墊料2次。每籠大鼠不超過(guò)5只。分組設(shè)置造模前將所有大鼠隨機(jī)分為兩組:造模組和正常對(duì)照組(E組)。造模后選取符合模型標(biāo)準(zhǔn)的大鼠,隨機(jī)分為4組:A組:牛蒡子粉組;B組:牛蒡子水提組;C組:牛蒡子醇提組;D組:模型組。糖尿病大鼠模型建立造模前大鼠禁食12h,鏈脲佐菌素(STZ)臨用前用0.1mol/L、PH4.0的枸櫞酸緩沖液配成1%的濃度,以55mg/kg體重的劑量,腹腔內(nèi)一次性注射。72小時(shí)后檢測(cè)空腹血糖和尿糖水平,以血糖>16.7mmol/L且尿糖檢測(cè)在+++~++++以上作為模型入選。正常組僅予以等量的枸櫞酸緩沖液腹腔注射。動(dòng)物處理確定造模大鼠達(dá)到模型標(biāo)準(zhǔn)后,穩(wěn)定3天后開(kāi)始灌胃用藥。A組每只鼠每日予12g含藥飼料(含生藥2.5g)后,可自由進(jìn)食。B、C組每只鼠每日予0.5ml藥液(相當(dāng)于2.5g生藥的提取物)灌胃,D、E組每只鼠予0.5ml自來(lái)水灌胃。每天統(tǒng)計(jì)各籠大鼠的飲水量,每周統(tǒng)計(jì)各籠大鼠的進(jìn)食量,每周稱量各大鼠的體重變化。標(biāo)本收集與處理第6周末稱量大鼠的體重,在無(wú)菌條件下,以戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,取雙腎稱重,雙腎沿正中剖開(kāi),右腎置于液氮罐中,用于檢測(cè)腎組織PKC的活性TGF-β1和MCP-1mRNA的表達(dá)。腎組織TGF-β1和MCP-1mRNA檢測(cè)采用異硫氰酸胍法,具體步驟如下:組織標(biāo)本總RNA抽提:①將一小塊(約100mg)腎組織放入經(jīng)高溫烘烤祛除RNA酶的培養(yǎng)皿中,用手術(shù)剪剪碎后,迅速轉(zhuǎn)移到高溫烘烤和滅菌的5ml玻璃勻漿瓶中,加1mlTrizol,將勻漿瓶埋入冰中,啟動(dòng)電動(dòng)勻漿器勻漿2min。②加入200μl氯仿,劇烈振蕩后,室溫放置2min。③用低溫離心機(jī),12000g,4℃離心10min。④將上清液轉(zhuǎn)移到RNasefree的1.5ml離心管(Axygen)中,用200μl氯仿再次抽提一次。⑤上清(0.5ml)轉(zhuǎn)移到RNasefree的1.5ml離心管中,加入500μl異丙醇,混勻,室溫放置5min后,4℃12,000g,離心10min。小心移去上清,防止丟失沉淀。⑥用75%乙醇洗兩次,每次700μl,7500g,4oC離心2min,盡可能徹底除去殘余溶液,真空干燥3min。⑦RNA沉淀用100μlDEPC處理的無(wú)菌水溶解。⑧待樣品全部溶解后,測(cè)定OD260和OD280。用該法抽提的RNAOD260/280比值在1.9~2.1之間。抽提RNA直接用于RT反應(yīng),按1OD=40ug確定的RNA的量。⑨采用1%Agarose甲醛變性電泳方法檢測(cè)RNA的完整性。采用該法抽提的RNA沒(méi)有發(fā)生RNA降解。電泳的具體方法略。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)RT反應(yīng):①在RNasefree的1.5ml離心管中,加入2μg總RNA,0.5μlRNaseInhibitor(Promega),2μl100ng/mlOligo(dT)15+18(15mer與18mer各50ng/ml,由上海博彩生物公司合成)和適量的DEPC處理的無(wú)菌水,使反應(yīng)的總體積為9.5μl?；靹?65℃保溫5min。取出室溫放置10min。短暫離心將溶液收集到管底。②按下列次序加入試劑,進(jìn)行RT反應(yīng):4μl5XFirstStrandBuffer(Gibco/BRL),0.5μlRNaseInhibitor(Promega),2μl100mMDTT(Gibco/BRL),2μl4XdNTPmix(dATP,dCTP,dGTP,dTTP各10mM),1μl200UMMLVReverseTranscriptase(Gibco/BRL)。③混勻,37℃保溫60min。④90℃處理5min,冰上冷卻,4℃溫離心將溶液收集到管底,RT產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增:①引物同上所述。②擴(kuò)增:PCR擴(kuò)增條件如下:94℃45秒,預(yù)變性120秒,60℃退火45秒,72℃延伸60秒,循環(huán)35次,最后延伸300秒。DNA擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)和半定量分析:DNA擴(kuò)增產(chǎn)物用1.6%的Agarose電泳和EB染色后用TanonGIS-1000數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)分析。統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS10.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果一般情況正常組大鼠體重增長(zhǎng)明顯,精神狀況良好,動(dòng)作自如,反應(yīng)靈敏,毛皮有光澤。DN模型組大鼠明顯消瘦,多飲多尿、精神萎糜,反應(yīng)遲鈍,毛豎無(wú)光澤,動(dòng)作遲緩。中藥各治療組精神狀況均良好,動(dòng)作自如,反應(yīng)靈敏度較正常組稍差。腎組織TGF-β1和MCP-1mRNA表達(dá)結(jié)果(表1):本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的產(chǎn)物大小與預(yù)期值一致:目標(biāo)片段TGFβ1400bp,MCP-1450bp;內(nèi)對(duì)照為Actin240bp。RT-PCR的電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。A組:lane1=sample1~9B組:lane2=10~20C組:lane3=21~29D組:lane4=30~37E組:lane5=38~42M=pUC19MspIdigestTGF-β1mRNA表達(dá):模型組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。模型組比正常組高,差異顯著。各用藥組比模型組低,有顯著性差異;牛蒡子醇提治療組及牛蒡子水提組與正常組相比較無(wú)顯著性差異,此2組TGF-β1mRNA表達(dá)低于牛蒡子粉組,有明顯差異(P<0.05)。MCP-1mRNA表達(dá):模型組>牛蒡子水提物治療組>牛蒡子粉治療組>牛蒡子醇提物治療組>正常組。模型組較正常組及各用藥組高,差異顯著;牛蒡子醇提物治療組、牛蒡子粉治療組比牛蒡子水提物治療組低,差異顯著(P<0.05),牛蒡子醇提治療組與正常組相比較無(wú)顯著性差異。3作用機(jī)理討論減輕腎皮質(zhì)單核趨化蛋白(MCP-1)mRNA的表達(dá)MCP-1是最重要的趨化單核細(xì)胞在組織浸潤(rùn)的細(xì)胞因子。MCP-1是主要趨化、激活巨噬細(xì)胞的趨化因子,研究認(rèn)為腎小球中單核細(xì)胞的浸潤(rùn)與ECM的積聚及腎小球硬化癥的發(fā)展相關(guān)聯(lián)。Rovin等研究表明DN時(shí)腎臟局部能合成MCP-1,且與腎小球損傷有關(guān)。MCP-1在DN患者中增高的可能機(jī)制為:(1)長(zhǎng)期的高血糖代謝紊亂是DN發(fā)病的根本原因,而高糖有直接刺激MCP-1mRNA表達(dá)及蛋白含量增高的作用,該作用可能是由PKC介導(dǎo),用PKC抑制劑可降低高糖環(huán)境中的MCP-1。(2)DN患者中IL-1、TNF-α、PDGF等細(xì)胞因子均增高,它們可刺激腎臟內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞表達(dá)高水平的MCP-1。(3)DN患者存在血脂代謝紊亂,其升高的低密度脂蛋白(LDL)及其氧化產(chǎn)物OX-LDL均可刺激系膜細(xì)胞MCP-1mRNA表達(dá)增高。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:牛蒡子醇提治療組可減輕MCP-1mRNA表達(dá),提示牛蒡子提取物可能通過(guò)減輕MCP-1mRNA表達(dá)而改善糖尿病大鼠的腎損害。降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β1)mRNA的表達(dá)腎小球多種實(shí)質(zhì)細(xì)胞,尤其是系膜細(xì)胞,可豐富的表達(dá)TGF-β1mRNA,合成和分泌TGF-β1,并擁有TGF-β1特異性受體。TGF-β1增加系膜細(xì)胞所有細(xì)胞外基質(zhì)成份,如膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、纖維連接蛋白、層粘連蛋白(laminin)、蛋白多糖及mRNA表達(dá)、合成和分泌;TGF-β1可使腎小球上皮細(xì)胞纖維連接蛋白、蛋白多糖、decorin及膠原蛋白合成增加,抑制細(xì)胞外降解酶的合成和活性。TGF-β1還可抑制組織蛋白水解酶mRNA的表達(dá)、合成和分泌,使細(xì)胞外基質(zhì)降解減少,刺激某些蛋白水解酶抑制劑的產(chǎn)生,有效的使蛋白水解酶活性降低,致細(xì)胞外間質(zhì)成份穩(wěn)定升高,促進(jìn)腎小球硬化?？梢?jiàn),TGF-(β1是糖尿病腎小球硬化的一個(gè)生長(zhǎng)介導(dǎo)因子。眾多實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明:糖尿病大鼠及糖尿病腎病患者活檢組織TGF-β1mRNA的表達(dá)及蛋白含量均明顯升高,同時(shí)伴腎臟肥大和細(xì)胞外基質(zhì)增生。Shankland發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠2周時(shí),其腎臟皮質(zhì)TGF-β1mRNA表達(dá)較正常大鼠高2~3倍。Nakamura觀察到糖尿病大鼠24周腎小球內(nèi)TGF-β1比正常大鼠高4倍。TGF-β1在DN發(fā)病中作用可概括為:促使腎臟肥大,增加系膜細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,并通過(guò)增加基質(zhì)降解酶抑制物的活性,抑制基質(zhì)降解酶合成,減少ECM的分解。大量研究表明,TGF-β1在促進(jìn)腎小球病變發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,如調(diào)節(jié)腎小球固有細(xì)胞增殖,促進(jìn)ECM合成和分泌,改變基質(zhì)降解酶及其抑制因子的表達(dá)量和活性等。腎臟肥大可能與TGF-β1表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)。TGF-β1可能為DN發(fā)病機(jī)制的最后通路:高血糖狀態(tài)下,有多種生化異常及微循環(huán)障礙共同參與DN的發(fā)生發(fā)展,包括蛋白激酶C的激活、蛋白非酶糖化、氧化應(yīng)激、腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性增