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文檔簡(jiǎn)介

第四章酶的提取與分離純化預(yù)處理(pretreatment):包括固液分離和細(xì)胞破碎(分離胞內(nèi)產(chǎn)物)等。初步純化(roughfractionation)(提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化(finefractionation)(精制):除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥(concentrationanddesiccation)(成品加工):使酶與溶劑分離的過程。第三節(jié)電泳

電泳(electrophoresis,EP):

指帶電粒子在電場(chǎng)中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程。電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場(chǎng)中遷移速度的不同而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。一、電泳的基本理論

1.原理:

在一定pH條件下(用buffer),不同大小、形狀及帶電顆粒在電場(chǎng)中的移動(dòng)速度不同(用遷移率表示),各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。

+-

遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)內(nèi)在特性:顆粒性質(zhì)(凈電荷量,顆粒大小、形狀)外界條件:電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性

將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng),受到的電引力為:

F引=EQ

在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV

當(dāng)F引=F阻時(shí)EQ=6πrηVEQV=6πrη

影響遷移率的因素:1)顆粒性質(zhì):

Q越大、r越小、形狀越接近球形,v越快。2)電場(chǎng)強(qiáng)度:E越高,v越快。3)溶液性質(zhì):

pH值:離pI越遠(yuǎn),v越快。(用buffer保持恒定)離子強(qiáng)度:離子強(qiáng)度越高,v越低。原因:離子氛(ionicatmosphere)。通常,緩沖液離子強(qiáng)度在0.02-0.2之間。4)電滲:在電場(chǎng)中,液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。自由界面電泳:指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。區(qū)帶電泳:指有支持介質(zhì)的電泳,待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用:防止電泳過程中的對(duì)流和擴(kuò)散。2.電泳的分類按支持介質(zhì)種類的不同,區(qū)帶電泳可分為:①紙電泳:②醋酸纖維素薄膜電泳:。以上兩種類型的電泳,由于介質(zhì)的孔徑度大,沒有分子篩效應(yīng),主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。

③瓊脂糖凝膠電泳:一般用于核酸的分離分析。④聚丙烯酰胺凝膠電泳:可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。

3.電泳常用設(shè)備

(1)電泳儀:為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀(600V)

高壓電泳儀(3000V)

超高壓電泳儀(30000V~50000V)(2)電泳槽:

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽(3)附屬設(shè)備:

水平板式電泳槽垂直板式電泳槽二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。

1.原理

聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體(acrylamide,簡(jiǎn)稱Acr)和交聯(lián)劑N,N’-甲叉雙丙烯酰胺(methylanebisacrylamide,簡(jiǎn)稱Bis)在催化劑和加速劑作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CHC=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種:1)化學(xué)催化系統(tǒng):AP-TEMED

催化劑:過硫酸銨(ammoniumpersulfate,AP)加速劑:TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)2)光催化系統(tǒng):核黃素-光-(TEMED)催化劑:核黃素(維生素B2)

引發(fā)劑:光

TEMED的存在,可加速聚合。.聚丙烯酰胺凝膠:丙烯酰胺+N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合而成

凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度(T)和交聯(lián)度(C)。

T=

C=

凝膠濃度越大(?。?,孔徑越?。ù螅?,可分離分子量較?。ù螅┑念w粒。

Acr與Bis的重量比應(yīng)在30左右。

凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr(g)+Bis(g)V(ml)X100%Acr(g)+Bis(g)Bis(g)X100%樣品分子量(Da)適宜的凝膠濃度(%)蛋白質(zhì)<1041~4×1044×104~1×105105~5×105>5×10520~3015~2010~155~102~5聚丙烯酰胺凝膠濃度參考表2.分離效應(yīng)

PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng),分為:連續(xù)電泳(continuouselectrophoresis)采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳(discontinuouselectrophoresis)

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)

連續(xù)PAGE1)電荷效應(yīng):

分離膠中,蛋白質(zhì)表面凈電荷不同,遷移率不同。2)分子篩效應(yīng):大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時(shí),受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3)濃縮效應(yīng):使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶,然后再進(jìn)入分離膠進(jìn)行分離。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:

1.凝膠由上、下兩層凝膠組成,兩層凝膠的孔徑不同,上層為大孔徑的濃縮膠,下層為小孔徑的分離膠。

2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液,濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液,而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。因此,在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里,存在三種物理效應(yīng),即樣品的濃縮效應(yīng),凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng),提高了分辨率。8.38.38.96.7聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品緩沖液pH6.7(2)濃縮膠pH6.7

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

三、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE)簡(jiǎn)稱SDS-PAGE。是目前測(cè)定蛋白質(zhì)亞基相對(duì)分子量(relativemolecularmass,Mr)的一種最好的辦法。

SDSseparatesproteinsbyMW1.原理:

SDS是一種陰離子去污劑,帶有大量負(fù)電荷,與蛋白質(zhì)結(jié)合后使蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷大大超過了天然蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷,因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵,巰基乙醇使二硫鍵打開,引起蛋白質(zhì)構(gòu)象改變,使蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物形狀近似橢圓形,短軸相同(1.8nm),長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此,蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響,只與橢圓棒長度(蛋白質(zhì)分子量)有關(guān)。

兩者關(guān)系:蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,符合下式:logMW=K-bXMW:分子量;X:遷移率;k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖,可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳,根據(jù)其相對(duì)遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。2.操作:(SDS及PAGE,即變性及非變性)1)制膠:

(變性:buffer中加0.4%SDS)

a.分離膠:根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠(查表),配制分離膠溶液:

Acr:Bis=29:1,分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠,加水使液面平坦,室溫0.5h聚合完全。

b.濃縮膠:用濃縮膠buffer。插上梳子。2)樣品制備:

a.PAGE:樣品+樣品緩沖液[蔗糖或甘油(增加比重)+指示劑溴酚藍(lán)]b.SDS:樣品+樣品緩沖液(SDS,甘油,巰基乙醇,溴酚藍(lán)),煮沸2~5min,以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3)加樣及電泳:

SDS:電極buffer中加0.1%SDS,溴酚藍(lán)距下端1cm時(shí)停止電泳。4)固定及染色a.固定:將凝膠浸于7%乙酸或12.5%三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分。b.染色:

考馬斯亮藍(lán)染色法

銀染法(靈敏度比前者高100倍)其它的染色方法:氨基黑、阿爾辛藍(lán),過碘酸-Schiff試劑(糖蛋白)。理想顯色劑的7S

安全(safety):

靈敏(sensitivity):

簡(jiǎn)單(simplicity):

特異性(specificity):

快速(speed):

穩(wěn)定(stability):

兼容性(synergy):四、等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)的特性,以聚丙烯酰胺為電泳支持物,在其中加入載體兩性電解質(zhì)(商品名:Ampholine,一種含有各種連續(xù)

pI的小分子混合物)的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(IEF)。1.原理

兩性電解質(zhì)載體在電場(chǎng)作用下,按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續(xù)的pH梯度。蛋白質(zhì)在此pH梯度凝膠中泳動(dòng),當(dāng)遷移至pH值等于pI處時(shí)不再泳動(dòng),被濃縮成狹窄的區(qū)帶。兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水,有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。(2)導(dǎo)電性能好——以保持電場(chǎng)強(qiáng)度的均勻性。(3)分子量小——電泳后易分離除去。(4)化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測(cè)定。等電聚焦電泳2.操作:

1)凝膠配制:凝膠濃度T為5%~7.5%(C=3%

左右)

2)加樣:任意位置

3)電泳:

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