乳酸乳球菌suc-和nis+的轉(zhuǎn)移

乳酸乳球菌suc-和nis+的轉(zhuǎn)移

2.3生殖器是具有最廣泛使用價值的二級代謝物2.3.1適用的乳酸球形ns許多抗菌藥物可能是例如nisin、diphoin、lacocilin、bacurin、acidophilin和bulgarin?，F(xiàn)已知道產(chǎn)生Nisin能力與質(zhì)粒有關(guān)。大部分乳酸乳球菌菌種是由11種基因參與Nisin的合成,此11種基因稱為NisinABTCIPRKFEG,而這些基因聚集在一個大的轉(zhuǎn)座子上,其中nisA可轉(zhuǎn)錄出結(jié)構(gòu)基因,而nisR可轉(zhuǎn)錄出一個反饋調(diào)節(jié)蛋白質(zhì),nisK可轉(zhuǎn)錄出一個組氨酸激酶NisK、NisR及NisK二者構(gòu)成一個成分調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與Nisin的合成。Gonzales等人研究了在乳球菌間Suc-和Nis+的轉(zhuǎn)移。從乳酸鏈球菌ATCC11454上除去質(zhì)粒pDR1(38.1Mdal)給予Lac-、Prt-、Suc+和Nis-;pDR21(29Mdal)缺乏給予Lac+、Prt+、Suc-和Nis+;質(zhì)粒均丟失的二者給予Lac-、Prt+、Suc-、Nis-。通過提高溫度,可能得到Lac-Suc+,Lac+Suc-,Lac-Suc-,誘導(dǎo)的乳酸鏈球菌新菌株。接合試驗得出Lac+Suc+新菌株。Suc+Nis+和Nisin抗性從一個乳酸鏈球菌轉(zhuǎn)移到另一個乳酸鏈球菌上。乳酸鏈球菌丁二酮亞種細(xì)胞在有DNAasel存在下,停滯于硝化纖微素中。對Suc+Nis+表型穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)親本菌株分別生長于37℃、40℃和42℃時,Suc-Nis-菌株的發(fā)生率分別為6%、5%和7%?？墒钱?dāng)乳酸鏈球菌Suc+Nis+接合的菌株生長于上述溫度下,未測出有Suc-Nis-菌株,同樣乳酸鏈球菌丁二酮亞種的Suc+Nis+菌株生長在37℃或40℃時,他們的表型并不丟失。Nisin對熱穩(wěn)定性為pH=2,100℃/30min;pH=11,63℃/30min。Ruyter等人利用不產(chǎn)生Nisin的菌株乳酸乳桿菌NZ9800、3900等進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),將NZ3900缺失了nisI和nisFEG基因,從而保留了nisRK基因,適合Nisin誘導(dǎo)。胞外多糖的產(chǎn)生,作者已在本刊第二期綜述了這方面的研究情況。2.3.2乳酸鏈球菌胞外sod的生產(chǎn)老化與乳酸菌間是有關(guān)系的,近幾年人們已認(rèn)識到,過氧化類脂和自由基對老化起作用。老化與活性氧之間,特別是由酶和非酶反應(yīng)產(chǎn)生的超氧化自由基已引起人們的注意,并且自由基引起的反應(yīng),脂肪的超氧化作用,對老化也有較大的影響。超氧化類脂的產(chǎn)生要求有不飽和脂肪酸或活性氧。輻射和金屬離子對不飽和脂肪酸活化起作用,而活化氧的形式主要有:超氧化自由基(O2-)、OH-和單線態(tài)氧(1O2)。超歧化氧化酶(SOD)有助于去除這些氧的形式中的O2-、NADH氧化酶、NADH過氧化物酶OH及OH-作用。食品和藥品中的這種酶的使用就是基于這種原理。Hansson等人研究了乳酸鏈球菌胞外SOD的產(chǎn)生,并對其有效提取方法進(jìn)行了有效的研究。通過過濾發(fā)酵法生產(chǎn)SOD,發(fā)酵微生物為乳酸鏈球菌ATCC1943和相關(guān)菌株(SL)等,發(fā)酵條件為37℃,培養(yǎng)24h,然后通過離心收集得到(見表5)。以小丸形式飼喂鼠,正常劑量,時間從10周到27個月,并未發(fā)現(xiàn)有任何的毒副反應(yīng),也不產(chǎn)生血壓升高等作用。而對來自于軟骨基礎(chǔ)的、防止老化的硫酸軟骨素的保持,皮膚張力變化,阻止器官萎縮,以及與老化有關(guān)的骨骼肌,維持較底的血漿水平和正常水平的超氧化類脂含量。幾種雙歧桿菌產(chǎn)生的NADH氧化酶、NADH過氧化物酶及SOD活性如表6、表7所示。Sander等人將sodA啟動子與lacZ基因接合,在有氧狀態(tài)下,lacZ基因表現(xiàn)為無氧狀態(tài)下的2倍。食品級乳酸菌優(yōu)良特性,已引起食品、微生物、生物、醫(yī)學(xué)等許多領(lǐng)域研究者的興趣。利用遺傳和生物技術(shù)培育抗噬菌體菌株;大量蛋白質(zhì)產(chǎn)生乳酸菌菌株,提高乳糖代謝、蛋白質(zhì)分解、SOD產(chǎn)生、抗噬菌體以及具有生物藥理功能的EPS產(chǎn)生等特性方面,將產(chǎn)生極其重要的影響。利用過濾發(fā)酵、添加發(fā)酵等方法,在發(fā)酵產(chǎn)品、新藥開發(fā)、生化制劑生產(chǎn)等方面將發(fā)揮巨大作用。3發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)3.1穩(wěn)定ph值發(fā)酵法由于乳酸菌在發(fā)酵過程中,代謝產(chǎn)生的許多物質(zhì),例如乳酸、醋酸、細(xì)菌素等對自身生長反過來又具有抑制作用。因此消除這些代謝產(chǎn)物的抑制,并補充營養(yǎng)物質(zhì),可以較大幅度提高發(fā)酵劑中的乳酸菌數(shù)量。穩(wěn)定pH值發(fā)酵法主要有過濾發(fā)酵法和連續(xù)流加堿發(fā)酵法兩種。過濾發(fā)酵法是通過有效過濾膜將乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸等通過透析或超濾,從發(fā)酵液中加以除去;連續(xù)流加堿發(fā)酵法是根據(jù)發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸量,通過補加堿液,維持發(fā)酵液pH值的穩(wěn)定。3.2冷凍濃縮發(fā)酵劑的使用效果過去20年間,發(fā)酵乳技術(shù)重大突破之一,就在于改變了傳統(tǒng)液態(tài)發(fā)酵劑生產(chǎn)模式,冷凍、濃縮、干燥發(fā)酵劑在發(fā)酵乳生產(chǎn)中的應(yīng)用。例如生產(chǎn)10萬噸發(fā)酵乳,從母發(fā)酵劑到工作發(fā)酵劑,通常需要4代擴培;而利用1011冷凍濃縮發(fā)酵劑,僅需70～100g。直接使用冷凍濃縮發(fā)酵劑具有如下優(yōu)點:1)可以防止菌種在保存、擴培過程中,菌種活性、組成發(fā)生變化;2)可以有效地防止有害菌的污染;3)發(fā)酵工廠省去菌種的逐級擴培過程,可以節(jié)省原材料和勞動力的消耗,降低成本;4)冷凍濃縮發(fā)酵劑產(chǎn)品質(zhì)量均一,從而可以保證發(fā)酵乳產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定;5)冷凍濃縮發(fā)酵劑活性可以預(yù)先進(jìn)行測定,因此可以確保產(chǎn)品質(zhì)量;6)冷凍濃縮發(fā)酵劑接種量小,可以精確控制,并且容易混合均勻;7)對于嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等,由于發(fā)酵劑生產(chǎn)廠在技術(shù)、人員方面的專一、生產(chǎn)過程的良好控制,從而防止了發(fā)酵劑的缺陷。4發(fā)酵液中成成分的改進(jìn)原料乳的組成對發(fā)酵乳的品質(zhì)有影響,對原料乳組成成分的改進(jìn)是提高發(fā)酵乳品質(zhì)的重要手段。發(fā)酵過程中的遺傳和生物技術(shù)的應(yīng)用,可望在節(jié)能降耗、提高制品品質(zhì)以及生產(chǎn)出功能特性獨特的發(fā)酵乳制品。4.1用牛乳生產(chǎn)馬奶酒4.1.1模擬人乳在生產(chǎn)嬰兒發(fā)酵乳制品中,參照人乳組成,對牛乳組成成分進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整,從而使之更適合于嬰幼兒的飲用。目前國外這方面產(chǎn)品較多,如Lactana-B、Eledon、Pelargon、Femilact等,而我國在這方面還未進(jìn)行有意識的開發(fā)。4.1.2用牛乳生產(chǎn)馬奶酒用普通牛乳生產(chǎn)其他乳發(fā)酵制品,以解決這些原料乳不足的問題。例如用牛乳生產(chǎn)馬奶酒就是一個例子。前蘇聯(lián)開發(fā)的用牛乳生產(chǎn)馬奶酒的配方為:用34.6%全脂乳、0.8%脫脂乳、64.6%的非脂分離乳清,混合料的脂肪含量為0.9%～1.0%,容重為1.022～1.023kg/dm3。在使用前,干混合料用50～55℃的溫水復(fù)原,然后用(85～87)℃/(5～10)min熱處理,10～20MPa均質(zhì),并冷卻至32～35℃,接種發(fā)酵劑,加入0.5L、0.2g/kg的維生素C溶液,接種量為20%,混合料在28～32℃發(fā)酵3～4h,并不斷攪拌至酸度達(dá)70～80°T,冷卻至16～18℃,攪拌發(fā)酵1～2h,罐裝,于6～8℃成熟至成品。4.1.3適合于特殊病人的發(fā)酵乳這些特殊病人包括乳糖不耐癥者,乳蛋白過敏(象苯丙氨酸)者等需要的發(fā)酵乳。4.2發(fā)酵乳生產(chǎn)中的生長促進(jìn)物現(xiàn)已證實各種低聚糖對人體健康具有重要作用,并對乳酸菌,特別是雙歧桿菌具有生長促進(jìn)作用,因此各種生長促進(jìn)劑在發(fā)酵乳生產(chǎn)中得到了應(yīng)用,這些生長促進(jìn)物主要是:(1)天然添加物,如玉米浸出物、西紅柿汁、胡蘿卜汁等。(2)各種低聚糖,包括乳果糖、低聚麥芽糖、低聚半乳糖等。在發(fā)酵乳產(chǎn)品中這些物質(zhì)的添加,除可促進(jìn)發(fā)酵微生物的生長外,另外殘留于產(chǎn)品中的部分,隨著食用進(jìn)入腸道后,可促進(jìn)體內(nèi)有益菌的生長,特別是體內(nèi)雙歧桿菌的生長。4.3乳酸菌及其酶近20多年來,發(fā)酵乳的消費量逐漸增大,主要基于下述幾方面的原因:(1)采用牛乳發(fā)酵而成,牛乳中含有各種對人體健康和營養(yǎng)需要的有益物質(zhì);(2)乳酸菌作為發(fā)酵劑菌種使用,有助于定殖腸道區(qū)域;(3)由于乳酸菌及其酶的作用,它們更有利于消化吸收;(4)它們含有乳酸菌代謝產(chǎn)物、原料降解產(chǎn)物以及良好的物理特性等。乳酸菌有關(guān)遺傳及生物技術(shù)在發(fā)酵乳中應(yīng)用如圖2所示。5發(fā)酵乳液的營養(yǎng)和生理功能5.1對發(fā)酵乳的營養(yǎng)價值的影響乳酸菌在乳的發(fā)酵過程中,是對乳的預(yù)消化過程,除乳糖部分分解成乳酸、醋酸等有機酸外,蛋白質(zhì)、脂肪也得到適當(dāng)?shù)慕到?產(chǎn)生大量的氨基酸,并合成大量B族維生素,使乳形成良好的組織質(zhì)地,提高消化吸收性能,同時也促進(jìn)人體對Ca、Fe、P的消化吸收,因此發(fā)酵乳的營養(yǎng)價值大大提高。5.2發(fā)酵乳液的廣告5.2.1抑菌效果的影響胎兒出身前,處于無菌狀態(tài),初生嬰兒第一次排便(胎便)通常是無菌的。出生3～4h后鏈球菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、乳桿菌等便出現(xiàn)于腸道內(nèi),經(jīng)哺乳后,菌數(shù)迅速增加,至4～7天雙歧桿菌開始占優(yōu)勢。健康人體中腸內(nèi)菌群相當(dāng)穩(wěn)定,但可能因食物、藥物、環(huán)境等因素影響而變化。發(fā)酵乳中的乳酸菌可以達(dá)到排除致病菌、維持腸道菌群平衡的作用:1)利用營養(yǎng)及上皮細(xì)胞的吸附競爭作用,以防止致病菌在腸道的定殖;或者由于大量乳酸菌的存在,形成生物膜造成屏蔽作用而防止致病菌接近上皮細(xì)胞。2)產(chǎn)生的有機酸降低pH值;或產(chǎn)生抑菌素、抗生素及脫結(jié)合型的膽酸等抑制致病菌的生長。5.2.2克氏原螯蝦對大鼠的免疫作用抗腫瘤免疫反應(yīng)中,巨噬細(xì)胞的殺瘤作用常具有重要意義。許多研究結(jié)果表明,乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)品,均能激活機體的免疫系統(tǒng),特別是巨嗜細(xì)胞、NK細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞,而對T細(xì)胞本無直接作用。Vesely等人(1985)鼠的飼喂試驗發(fā)現(xiàn)活菌和熱處理的酸奶,至15天均能提高鼠的Ig?G2a和Ig?M,網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬作用活性增強;從青春雙歧桿菌ATCC15703培養(yǎng)物的上清液中分離得到的胞外物質(zhì),能誘導(dǎo)鼠肝細(xì)胞的脾變活性,從胞外物質(zhì)中分離得到的EPS,顯示出較高的淋巴增殖應(yīng)答內(nèi)部促進(jìn)作用。瑞士乳桿菌約古特亞種產(chǎn)生的胞外多糖,對植入到鼠中的腹水肉瘤180具有抗腫瘤活性,可能是介于宿主介導(dǎo)的應(yīng)答。由高加索乳桿菌和糞便菌株產(chǎn)生的開菲爾糖(kefiran)能提高腫瘤鼠的遲發(fā)型過敏性應(yīng)答。因此可以看出,多糖免疫性的提高,是通過T細(xì)胞誘導(dǎo)的,而不是B細(xì)胞。來自于乳酸菌發(fā)酵乳或醫(yī)療制劑的外源乳酸菌比腸道固有乳酸菌具有更強的免疫促進(jìn)作用,而且混合菌種比單一菌株的促進(jìn)作用強。5.2.3其他方面的作用(1)對糞便酶的抑制作用動物試驗已經(jīng)證實,結(jié)腸中的細(xì)菌酶,特別是一些能催化致癌前體物質(zhì)向致癌物質(zhì)轉(zhuǎn)化的糞便酶起源于糞便病原微生物菌叢,產(chǎn)生的這些酶主要是:β-葡糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、硝基還原酶、偶氮還原酶和甾醇7-α-脫氫木聚糖酶等。一些乳酸菌,如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等能耐受胃部不利條件而到達(dá)腸道的細(xì)菌,在抑制這些酶的生成及活性上起重要作用,其作用形式包括:1)代謝產(chǎn)生的乳酸、醋酸等有機酸,抑制病原微生物的生長和發(fā)育;2)代謝產(chǎn)生的一些細(xì)菌素,抑制有害微生物的生長;3)促進(jìn)胃腸蠕動,減少致癌物質(zhì)與上皮細(xì)胞的接觸以及抑制粘膜上皮細(xì)胞的再生;4)形成不利于糞便酶作用的環(huán)境。(2)誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生NO在哺乳動物機體的物質(zhì)代謝、信息傳遞以及防御疾病方面起重要作用。目前很多證據(jù)表明,NO的誘導(dǎo)合成是活化的巨嗜細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要機制之一。NO可以通過下述兩個可能機制殺傷腫瘤細(xì)胞。1)NO能與腫瘤代謝關(guān)鍵酶活性部位的Fe-S基結(jié)合形成Fe-亞硝基復(fù)合物,從而使酶失活,繼而引起細(xì)胞毒性;2)NO能與氧結(jié)合,最終形成強有力的殺傷細(xì)胞的羥自由基和NO2。WPG和磷壁酸是NO合成酶的誘導(dǎo)劑。(3)抗突變活性致癌作用是通過具有致癌物誘導(dǎo)動物細(xì)胞突變開始的。一些乳酸菌可抑制動物細(xì)胞的突變。Hosono(1986)報道了德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳桿菌乳酸亞種制作的發(fā)酵乳,對4-硝基喹林-N-Oxide(4NQO)以及埃希氏大腸桿菌B/rWP2trpher誘導(dǎo)的突變作用,具有抑制活性。人體腸道固有乳酸菌對3-氨基-1,4-二甲基-5吡啶(4,4b)吲哚(Trp-p)和3-氨基-1-甲基-5H-5-吡啶(4,3b)吲哚(Trp-p)誘變基有較強的抑制作用。這些研究結(jié)果表明一些乳酸菌可通過抗突變作用達(dá)到抗腫瘤的目的。(4)參加或干擾細(xì)胞物質(zhì)的代謝途徑a.影響血液供應(yīng)鑒于細(xì)菌素能引起腫瘤細(xì)胞出血性壞死,曾經(jīng)設(shè)想多糖的抗腫瘤作用可能影響腫瘤細(xì)胞的血液供應(yīng)。b.對細(xì)胞體積和空胞化的影響①多糖分子可以從腹膜腔吸附進(jìn)入血液循環(huán),然后活化多糖分子;其活化的部分?jǐn)U散回到腹膜腔內(nèi)以直接影響腫瘤細(xì)胞。②多糖分子或其一部分,可以刺激一種器官或組織(如腎上腺和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)),再分泌一種物質(zhì)作用于腫瘤細(xì)胞。(5)細(xì)胞膜接觸抑制的功能DEAE-右旋糖苷,對于腹水腫瘤細(xì)胞,在體內(nèi)和體外試驗表明有抑制效應(yīng)。早期的研究表明,腫瘤細(xì)胞表面具有強的負(fù)電荷,DEAE-右旋糖苷可能結(jié)合這些電荷,使細(xì)胞表面部分的“中和”,有利于細(xì)胞、細(xì)胞間的接觸,接受信號以停止分裂。細(xì)胞表面電荷的中和,依賴于分子量的大小和取代程度,最大的效應(yīng)是具有高分子量(2000000)和最高取代度(50%)。因此推斷多糖的負(fù)電荷與抗腫瘤活性有關(guān)。乳酸菌作為一種非特異性生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,具有抗腫瘤的作用。目前對其機制的研究還很膚淺,今后應(yīng)從分子水平探討它對腫瘤細(xì)胞基因以及抑瘤基因的影響,同時對有效抗腫瘤成分尚需進(jìn)一步深入探討其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,并運用現(xiàn)代生物技術(shù)、高密度發(fā)酵技術(shù),培養(yǎng)活體細(xì)胞及有效代謝產(chǎn)物,為工業(yè)化生產(chǎn)抗腫瘤藥物創(chuàng)造條件。5.2.4乳糖酶基因型由于發(fā)酵乳中約有20%～40%的乳糖得到分解,同時發(fā)酵乳中還含有較高的乳糖酶,能進(jìn)一步參與分解乳糖;另外一些乳酸菌,如雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等,能抵御胃腸不利的環(huán)境,而到達(dá)大腸,進(jìn)一步分泌乳糖酶分解乳糖,因此發(fā)酵乳更適合于乳糖不耐癥患者。5.2.5乳酸菌抑制膽固醇合成牛乳中的膽固醇經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,其含量大大降低,且活性乳酸菌在人體內(nèi)也具有抑制膽固醇合成能力,可能是因為乳酸菌能抑制羥甲基戊二酸輔酶A還原酶(hydroxymethylataryCoA),從而降低膽固醇含量的緣故。5.2.6組患者的含量下降雙歧桿菌可抑制腸道中的腐敗菌的繁殖,從而減少腸道中內(nèi)毒素及尿素酶的含量,使血液中的內(nèi)毒素和氨的含量下降。肝病患者使用雙歧桿菌后,血中的氨、游離血清酚及游離氨基氮明顯減少,尿中的游離酚及尿素氨也明顯減少。另外乳酸菌產(chǎn)生有機酸、細(xì)菌素等能抑制腸道內(nèi)腐敗菌的生長,從而減少了這些細(xì)菌產(chǎn)生毒胺、靛基質(zhì)、吲哚、氨、糞臭素、硫化氫、致癌物質(zhì)和其他毒物等有害物質(zhì),使機體衰老過程變得緩慢。5.2.7乳酸菌代謝產(chǎn)物的活性口服乳酸菌的動物,經(jīng)放射線照射后,比未服乳酸菌的對照動物存活時間長