第03章-高效液相色譜法課件

1

第六節(jié)高效毛細(xì)管電泳

一、高效毛細(xì)管電泳儀器234二、高效毛細(xì)管電泳基本原理在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同可實(shí)現(xiàn)分離。經(jīng)典電泳分離法的不足：所用分離柱的柱徑大，柱較短，分離效率不高（遠(yuǎn)低于HPLC），溫度影響大。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)。5高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓?！锩?xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高?！镫妷荷?，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長增加，★高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。6電泳現(xiàn)象與電滲流現(xiàn)象電泳現(xiàn)象：帶電離子在電場(chǎng)作用下的遷移，速度v電泳電滲流現(xiàn)象：玻璃表面存在硅羥基,pH>3時(shí),形成雙電層，在高電場(chǎng)的作用下引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度v電滲流7分離過程：電場(chǎng)作用下,柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流兩種速度的矢量和正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致,在負(fù)極最先流出中性粒子無電泳現(xiàn)象,受電滲流影響,在陽離子后流出陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反，v電滲流>v電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。8分離類型1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）最普遍、最基本的一種分離模式。2.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）

將聚丙烯酰胺在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高?？煞蛛x測(cè)定蛋白質(zhì)、DNA等。93.毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜（MECC）在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。由于電泳流和電滲流的方向相反，且v電滲流>v電泳，則帶負(fù)電的膠束以較慢的速度向負(fù)極方向移動(dòng)，中性試樣分子在膠束相和溶液（水相）兩相間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長。可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍。1011三、儀器裝置

電壓：0～30KV。分離柱不涂敷任何固定液，紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器（可檢測(cè)到：10-19～10-21

mol/L）12四、影響柱效的因素及改進(jìn)方法熱效應(yīng)：焦耳熱是影響柱效的主要因素。采用外部冷卻的方法散熱，選擇合適的電壓和電解質(zhì)也是提高柱效的有效途徑。選擇合適的電解質(zhì)降低電阻，電流低于200微安，一般幾十微安。電滲流控制：電滲流的大小和方向，依賴于毛細(xì)管壁與溶液間電勢(shì)的極性和大小。使用添加劑可以改變電滲流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低電滲流；加入乙腈則可以增大電滲流。加入反轉(zhuǎn)劑，則可以改變電滲流的方向。13五、主要特點(diǎn)和應(yīng)用高分辨率：理論塔板數(shù)高達(dá)數(shù)百萬塊，甚至數(shù)千萬塊。高靈敏度：可檢測(cè)出低至10-21

mol/L濃度的物質(zhì)。高分析速度：可在3分鐘內(nèi)分離30種陰離子；1.7分鐘分離19種陽離子;4分鐘可分離10種蛋白質(zhì).試樣用量少：僅需幾nL（10-9L）的試樣儀器簡單，操作成本低：分析一個(gè)試樣僅需幾毫升流動(dòng)液。不足之處：進(jìn)樣不夠方便。應(yīng)用范圍相對(duì)較窄。14第七節(jié)紙層析和薄層層析法

一、紙層析和薄層層析分離過程紙層析和薄層層析也屬于色譜分析法。但與其它色譜方法不同的是在分離過程中一般不使用動(dòng)力源。紙層析和薄層層析流動(dòng)相的移動(dòng)是依靠毛細(xì)作用。

將試樣點(diǎn)在色譜濾紙或?qū)游霭宓囊欢耍⒃摱私谧鳛榱鲃?dòng)相的溶劑（常稱之為展開劑）中，隨著溶劑向上的移動(dòng)，經(jīng)過試樣點(diǎn)時(shí)，帶動(dòng)試樣向上運(yùn)動(dòng)。15比移值1617二、操作技術(shù)層析紙和層析板:特制的色層濾紙。按需要剪裁成長條形（或筒型）。層析板是用專門的涂布器把漿狀的吸附劑（硅膠或氧化鋁，200～250目）均勻地涂在長條形玻璃板上（厚度0.15～0.5mm）。干燥后即可使用。181.展開劑展開劑：由一種或多種溶劑按一定比例組成。如用紙層析分離氨基酸時(shí)，常用的展開劑組成和配比為：正丁醇：乙酸：水=4：1：1192.點(diǎn)樣點(diǎn)樣:用微量注射器或玻璃毛細(xì)管吸取一定量試樣點(diǎn)在原點(diǎn)上。試樣點(diǎn)的直徑一般應(yīng)小于5mm?？刹⑴劈c(diǎn)多個(gè)試樣同時(shí)展開。203.顯色檢測(cè)有些組份在紫外光照射下產(chǎn)生熒光，可在紫外燈下用鉛筆將組份斑點(diǎn)描繪出來。常用的顯色方法:噴灑顯色劑、碘蒸氣熏或氨水熏等。21三、特點(diǎn)及應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：平板色譜簡單、方便、