2024屆高考 二輪復(fù)習(xí) 大題分析與表達(dá)練基因工程類(lèi)大題突破作業(yè)（山東版）

6基因工程類(lèi)大題突破1.(2023·山東淄博三模)下圖為抗除草劑基因和質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖,科研人員將抗除草劑基因?qū)胗衩准?xì)胞,獲得了抗除草劑玉米。請(qǐng)回答下列問(wèn)題。(1)在質(zhì)粒上,啟動(dòng)子的作用是,圖中質(zhì)粒未標(biāo)出的必需元件是。

(2)用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗除草劑基因時(shí),需在引物1上設(shè)計(jì)限制酶的酶切位點(diǎn),即,抗除草劑基因的鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈。

(3)在構(gòu)建抗除草劑基因表達(dá)載體時(shí),為將抗除草劑基因正向連接在質(zhì)粒上需要雙酶切,用于切割質(zhì)粒的限制酶是,不選擇MboⅠ的理由是。

(4)在分子水平上,檢測(cè)抗除草劑基因是否導(dǎo)入玉米基因組可采用。在個(gè)體水平上,檢測(cè)轉(zhuǎn)抗除草劑基因玉米是否成功的方法是。

2.(2023·山東日照三模)原核生物和真核生物基因組中大片段DNA的定向整合擁有廣闊的應(yīng)用前景。但目前細(xì)菌中的定向整合系統(tǒng)存在諸多不足,如整合效率偏低、缺乏有效的篩選標(biāo)記物、可整合的片段大小有限等。研究者在原有細(xì)菌CRISPR/Cas系統(tǒng)基礎(chǔ)上嘗試構(gòu)建了CRISPRRNA-guided定向整合系統(tǒng),以期改善上述缺陷。(1)Cas蛋白是一種crRNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶,可催化(化學(xué)鍵名稱(chēng))水解,剪切特定雙鏈DNA片段。crRNA是一種短鏈RNA,它一端可與Cas蛋白結(jié)合,另一端通過(guò)原則與目標(biāo)DNA序列結(jié)合。

(2)轉(zhuǎn)座子(Tn)是一段特殊的DNA片段。轉(zhuǎn)座酶A和轉(zhuǎn)座酶B相互結(jié)合后可將Tn從原有的DNA鏈上切下,并將其整合到其他DNA片段上。為了使轉(zhuǎn)座子定向整合到特定位點(diǎn),將PCR擴(kuò)增得到的Cas基因和轉(zhuǎn)座酶A基因形成融合基因,并進(jìn)一步構(gòu)建下圖所示的CRISPRRNA-guided定向整合系統(tǒng)。為構(gòu)建圖示的CRISPRRNA-guided系統(tǒng),需要先設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增Cas基因、轉(zhuǎn)座酶基因等。用于擴(kuò)增Cas基因的引物需滿(mǎn)足的條件是。構(gòu)建時(shí),應(yīng)將翻譯終止序列設(shè)置在Cas基因和轉(zhuǎn)座酶A基因之后而不是設(shè)置在兩者之間,目的是。

(3)研究人員利用一定的方法將獲得的CRISPRRNA-guided系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌,統(tǒng)計(jì)并計(jì)算轉(zhuǎn)座子定向整合的效率,結(jié)果如下圖所示。①該結(jié)果表明,轉(zhuǎn)座子的定向整合效率高低與轉(zhuǎn)座子整合方向密切相關(guān)。為保證轉(zhuǎn)座子連接方向與預(yù)期相同,構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程中,對(duì)切割轉(zhuǎn)座子和切割載體的限制酶的要求是。

②該結(jié)果還可表明,CRISPRRNA-guided系統(tǒng)能夠有效解決篩選標(biāo)記物缺乏的問(wèn)題,依據(jù)是。

3.(2023·山東濟(jì)南模擬)研究人員從麻瘋樹(shù)油中篩選出能產(chǎn)生脂肪酶(LA)的細(xì)菌,經(jīng)誘變后獲得兩突變體菌株。突變體1菌株產(chǎn)生的酶LA1可耐高溫,突變體2菌株產(chǎn)生的酶LA2具有高催化效率,且LA1基因和LA2基因具有93%的同源性。研究人員期望采用PCR技術(shù)通過(guò)基因重組的方法優(yōu)化基因序列,獲得更適于高效生產(chǎn)的酶?；卮鹣铝袉?wèn)題。(1)采用PCR技術(shù)擴(kuò)增LA1時(shí),除模板、原料、酶、緩沖液等條件外,還需加入引物,引物的作用是。

(2)LA1基因的序列如圖1所示,若只使用1種引物,其他條件無(wú)誤,PCR后只合成出了與模板b鏈相同的單鏈。該實(shí)驗(yàn)使用的引物序列5'--3'(寫(xiě)出引物對(duì)應(yīng)的15個(gè)堿基),若擴(kuò)增圖中序列時(shí)引物選擇正確,PCR操作過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題,但對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳時(shí),發(fā)現(xiàn)除了目標(biāo)序列外還有很多非特異性條帶,請(qǐng)分析出現(xiàn)此情況的原因。(2點(diǎn)即可)。

圖1LA1基因(3)傳統(tǒng)的基因重組可采用限制酶切再用DNA連接酶連接的方式獲得重組的基因,但存在工作量大、效率低等缺點(diǎn),交錯(cuò)延伸PCR技術(shù)可以解決以上問(wèn)題。此技術(shù)采用LA1、LA2均作模板,具體流程如圖2(僅顯示其中一條鏈延伸情況)。經(jīng)過(guò)過(guò)程①80輪交錯(cuò)循環(huán)后,可獲得PCR混合產(chǎn)物,請(qǐng)比較PCR過(guò)程中的第三個(gè)步驟中,交錯(cuò)延伸PCR與普通PCR技術(shù)的區(qū)別是。最終獲得的混合PCR產(chǎn)物中,DNA分子的種類(lèi)數(shù)為(填字母)。

a.4種 b.16種c.64種 d.無(wú)法計(jì)算獲得的重組LA基因中,同時(shí)具有LA1和LA2基因序列的原因是

。圖2(4)將所獲得的PCR混合產(chǎn)物插入PM質(zhì)粒,圖中A為啟動(dòng)子、B為氯霉素抗性基因cat,C為終止子,D為asd-突變基因[asd基因是編碼細(xì)菌二氨基庚二酸(DAP)合成途徑的關(guān)鍵酶,DAP是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,asd基因缺失時(shí),將導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)對(duì)DAP依賴(lài)],E為復(fù)制原點(diǎn),箭頭處指不同限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。為使目的基因定向插入PM質(zhì)粒,交錯(cuò)延伸的PCR過(guò)程引物的5'端需引入酶的識(shí)別序列。為便于目的基因的檢測(cè)和鑒定,作為受體菌應(yīng)采用asd基因的受體菌,能從含有PM質(zhì)粒、重組PM質(zhì)粒的受體菌中將含有重組PM質(zhì)粒的受體菌篩選的選擇思路為

。

4.(2023·福建龍巖三模)重組PCR技術(shù)是一項(xiàng)新的PCR技術(shù),通過(guò)重組PCR技術(shù)能將兩個(gè)不同的DNA連接成為一個(gè)新DNA分子。某科研小組從豬源大腸桿菌中擴(kuò)增得到LTB和ST1兩個(gè)基因片段,利用重組PCR技術(shù)構(gòu)建了LTB—ST1融合基因,制備過(guò)程如圖1所示。回答下列問(wèn)題。圖1(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中,向反應(yīng)體系中加入的物質(zhì)除了引物和模板鏈外,還需要加入。利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,依據(jù)的生物學(xué)原理是。

(2)從P2、P3兩種引物的角度分析,LTB和ST1基因能夠融合的關(guān)鍵是PCR1和PCR2不能在同一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行,原因是

。

(3)②過(guò)程(填“需要”或“不需要”)加入引物,原因是

。

(4)科研小組為了檢測(cè)是否成功構(gòu)建出融合基因,將反應(yīng)后體系中的各種DNA分子進(jìn)行電泳,結(jié)果如圖2所示。則融合基因最可能是。

圖2答案：1.答案(1)RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA復(fù)制原點(diǎn)(2)EcoRⅠb(3)MunⅠ和BamHⅠ質(zhì)粒上有多個(gè)MboⅠ酶切位點(diǎn),MboⅠ會(huì)同時(shí)破壞潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因,造成終止子的丟失,且會(huì)導(dǎo)致載體自身環(huán)化等(4)DNA分子雜交技術(shù)用相應(yīng)除草劑噴灑轉(zhuǎn)抗除草劑基因玉米解析(1)啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)目的基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。質(zhì)粒上應(yīng)包括啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)等,復(fù)制原點(diǎn)是質(zhì)粒上必需的一段復(fù)制起始的序列,與重組質(zhì)粒的自主復(fù)制有關(guān),故圖中質(zhì)粒未標(biāo)注出的必需元件還有復(fù)制原點(diǎn)。(2)用PCR技術(shù)擴(kuò)增抗除草劑基因時(shí),需在引物1上設(shè)計(jì)限制酶的酶切位點(diǎn),MunⅠ會(huì)破壞抗除草劑基因,MunⅠ和EcoRⅠ產(chǎn)生的黏性末端相同,故引物1上設(shè)計(jì)EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。目的基因使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ進(jìn)行切割,在質(zhì)粒上,有BamHⅠ的酶切位點(diǎn),MunⅠ和EcoRⅠ產(chǎn)生的黏性末端相同,因此可以選擇MunⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒。由圖可知,抗除草劑基因的b鏈為轉(zhuǎn)錄的模板鏈。(3)質(zhì)粒上有多個(gè)MboⅠ酶切位點(diǎn),MboⅠ會(huì)同時(shí)破壞潮霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因,造成終止子丟失,且會(huì)導(dǎo)致載體自身環(huán)化等,故不選擇MboⅠ。(4)在分子水平上,檢測(cè)抗除草劑基因是否導(dǎo)入玉米基因組可采用DNA分子雜交技術(shù)(檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA上是否插入了目的基因)。從個(gè)體水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)抗除草劑基因玉米是否具有抗除草劑性狀,可采用相應(yīng)除草劑噴灑轉(zhuǎn)抗除草劑基因玉米。2.答案(1)磷酸二酯鍵堿基互補(bǔ)配對(duì)(2)兩種引物分別與兩條鏈3'端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì)讓Cas蛋白和轉(zhuǎn)座酶A形成融合蛋白,便于Cas蛋白引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶定位到crRNA所結(jié)合的DNA附近,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的定向整合(3)①利用兩種不同的限制酶切割轉(zhuǎn)座子和載體,且保證黏性末端的連接方向與預(yù)期相同②RL方向的定向整合效率接近100%,無(wú)需再用標(biāo)記物進(jìn)行篩選解析(1)分析題意可知,Cas蛋白是一種crRNA引導(dǎo)的內(nèi)切酶,作用相當(dāng)于限制酶,故可催化的是磷酸二酯鍵水解。crRNA是一種短鏈RNA,其能與目標(biāo)DNA結(jié)合是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則實(shí)現(xiàn)的。(2)引物通常用于目的基因的擴(kuò)增,用于擴(kuò)增Cas基因的引物需滿(mǎn)足的條件是兩種引物分別與兩條鏈3'端的堿基序列互補(bǔ)配對(duì),保證子鏈從5'→3'延伸。構(gòu)建時(shí),應(yīng)將翻譯終止序列設(shè)置在Cas基因和轉(zhuǎn)座酶A基因之后而不是設(shè)置在兩者之間,目的是讓Cas蛋白和轉(zhuǎn)座酶A形成融合蛋白,便于Cas蛋白引導(dǎo)轉(zhuǎn)座酶定位到crRNA所結(jié)合的DNA附近,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的定向整合。(3)①基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程中,需要利用兩種不同的限制酶切割轉(zhuǎn)座子和載體,且保證黏性末端的連接方向與預(yù)期相同(避免反向連接)。②據(jù)圖可知,橫坐標(biāo)是轉(zhuǎn)座子方向,縱坐標(biāo)是定向整合效率,圖示結(jié)果表示RL方向的定向整合效率接近100%,無(wú)需再用標(biāo)記物進(jìn)行篩選,故CRISPRRNA-guided系統(tǒng)能夠有效解決篩選標(biāo)記物缺乏的問(wèn)題。3.答案(1)使DNA聚合酶從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸(2)CTCCGATGGCGCATG復(fù)性溫度過(guò)低、引物特異性不高(3)每輪擴(kuò)增僅延伸一小段,經(jīng)過(guò)多輪“產(chǎn)物—模板”交替結(jié)合、延伸,最終擴(kuò)增出交錯(cuò)重組基因片段混合產(chǎn)物d第一輪以L(fǎng)A1(LA2)為模板合成的子鏈片段在第二輪復(fù)制時(shí)作為引物結(jié)合到LA2(LA1)的模板上繼續(xù)合成子鏈,經(jīng)多輪交錯(cuò)循環(huán)擴(kuò)增,可以使產(chǎn)物同時(shí)含有兩種基因的序列(4)XhoⅠ正常表達(dá)將正常培養(yǎng)基上分離出的受體菌單菌落,平移印制到含氯霉素的培養(yǎng)基上,在含氯霉素的培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)的菌落對(duì)應(yīng)的原菌落即為含有重組PM質(zhì)粒的受體菌解析(1)引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。引物的作用使DNA聚合酶從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸。(2)PCR后只合成出了與模板b鏈相同的單鏈,則引物的序列與a鏈3'端互補(bǔ),即5'-CTCCGATGGCGCATG-3'。擴(kuò)增時(shí)復(fù)性溫度過(guò)低,可能會(huì)導(dǎo)致引物與非互補(bǔ)配對(duì)的序列發(fā)生部分結(jié)合,會(huì)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的DNA分子從而出現(xiàn)多條條帶,即出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶;引物特異性不高,也會(huì)導(dǎo)致與非互補(bǔ)配對(duì)的序列發(fā)生部分結(jié)合,出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶。(3)交錯(cuò)延伸PCR與普通PCR技術(shù)的區(qū)別是每輪擴(kuò)增僅延伸一小段,經(jīng)過(guò)多輪“產(chǎn)物—模板”交替結(jié)合、延伸,最終擴(kuò)增出交錯(cuò)重組基因片段混合產(chǎn)物。分析題圖可知,由于采用交錯(cuò)延伸PCR的方法重組LA序列,故最終獲得的混合PCR產(chǎn)物中,LA基因片段的位置不確定,即DNA分子的種類(lèi)數(shù)無(wú)法計(jì)算。通過(guò)交錯(cuò)延伸PCR過(guò)程中,第一輪以L(fǎng)A1(LA2)為模板合成的子鏈片段在第二輪復(fù)制時(shí)作為引物結(jié)合到LA2(LA1)的模板上繼續(xù)合成子鏈,經(jīng)過(guò)多輪交錯(cuò)循環(huán)擴(kuò)增,可以使產(chǎn)物同時(shí)含有兩種基因的序列。(4)由于SalⅠ和Pvit2有兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn),若選用則會(huì)破壞標(biāo)記基因或復(fù)制原點(diǎn),因此要選用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行切割,為使目的基因定向插入PM質(zhì)粒,交錯(cuò)延伸的PCR過(guò)程引物的5'端需引入XhoⅠ的識(shí)別序列。PM質(zhì)粒中帶有asd-突變基因,為了篩選含有PM質(zhì)?；蛑亟MPM質(zhì)粒的受體菌,需要選用asd基因正常表達(dá)的受體菌。PM質(zhì)粒有完整的氯霉素抗性基因cat,重組PM質(zhì)粒沒(méi)有完整的氯霉素抗性基因cat,可以將正常培養(yǎng)基上分離出的受體菌單菌落平移印制到含氯霉素的培養(yǎng)基上,在含氯霉素的培養(yǎng)基上無(wú)法生長(zhǎng)的菌落對(duì)應(yīng)的原菌落即為含有重組PM質(zhì)粒的受體菌。4.答案(1)耐高溫的DNA聚合酶和四種脫氧核苷酸(或Taq酶和dNTP)DNA雙鏈復(fù)制(2)引物之間的結(jié)合會(huì)干擾引物和模板鏈的結(jié)合,從而影響PCR過(guò)程(3)不需要兩條母鏈的起始段位置的堿基序列即為引物,可以作為子鏈合成的引物,為DNA聚合酶提供3'端(4)3號(hào)DNA分子解析(1)PCR體系中需要加入的物質(zhì)有引物、模板鏈、耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)和dNTP等。PCR是一項(xiàng)