動物細(xì)胞培養(yǎng)

學(xué)習(xí)目標(biāo)動物細(xì)胞培養(yǎng)定義、過程、條件、應(yīng)用動物體細(xì)胞核移植技術(shù)定義、過程、應(yīng)用、存在問題動物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)一、動物細(xì)胞培養(yǎng)1.概念：細(xì)胞增殖

動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物有機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長和增殖。：3.過程取出組織胚胎或幼齡動物的器官組織剪碎組織胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)（培養(yǎng)液）置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)加培養(yǎng)液稀釋動物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來形成具有一定彈性和韌性的組織和器官胰蛋白酶處理取出組織胚胎或幼齡動物器官組織剪碎單個細(xì)胞細(xì)胞懸液

細(xì)胞貼壁

接觸抑制轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)（培養(yǎng)液）置于適宜環(huán)境中培養(yǎng)思考：轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)會發(fā)生哪些現(xiàn)象？■細(xì)胞貼壁：懸液中分散的細(xì)胞很快就貼附在瓶壁上，稱為細(xì)胞貼壁?！雠囵B(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿的內(nèi)表面光滑、無毒、易于帖附。細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，數(shù)量不斷增多。接觸抑制■當(dāng)貼壁細(xì)胞分裂生長到表面相互接觸時，細(xì)胞就會停止分裂增殖，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞的接觸抑制。取出組織胚胎或幼齡動物的器官組織剪碎組織胰蛋白酶或膠原蛋白酶處理單個細(xì)胞制成細(xì)胞懸液加培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（細(xì)胞貼壁；接觸抑制）原代培養(yǎng)定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)動物組織塊細(xì)胞懸液原代培養(yǎng)（細(xì)胞貼壁；接觸抑制）傳代培養(yǎng)胰蛋白酶處理分散成單個細(xì)胞幼齡動物的器官組織；動物胚胎加入培養(yǎng)液用胰蛋白酶等處理貼壁細(xì)胞；分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。適宜條件

當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞處于接觸抑制后，用胰蛋白酶處理，使細(xì)胞從瓶壁上脫離下來，然后加入新的培養(yǎng)液，將細(xì)胞分離稀釋，并從原培養(yǎng)瓶內(nèi)轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，這個過程稱傳代培養(yǎng)（分瓶培養(yǎng)的過程）。傳代培養(yǎng)10代細(xì)胞50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)細(xì)胞株無限傳代細(xì)胞系遺傳物質(zhì)已改變遺傳物質(zhì)未改變動物胚胎或幼齡動物的組織、器官配置細(xì)胞懸液胰蛋白酶處理轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶單個細(xì)胞加培養(yǎng)液稀釋分

瓶原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞貼壁、接觸抑制動物胚胎或幼齡動物的組織、器官配置細(xì)胞懸液胰蛋白酶處理10代細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶40-50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細(xì)胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。分

瓶繼續(xù)傳代培養(yǎng)少部分細(xì)胞獲得不死性，細(xì)胞突變，遺傳物質(zhì)已經(jīng)改變，等同于癌細(xì)胞。細(xì)胞株：一般說遺傳物質(zhì)未改變細(xì)胞系：遺傳物質(zhì)已改變原代培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)的原理：細(xì)胞增殖

為什么選用動物胚胎或幼齡個體的器官或組織做動物細(xì)胞培養(yǎng)材料？因?yàn)槠浼?xì)胞生命力旺盛，分裂能力強(qiáng)，分化程度低。

為什么培養(yǎng)前要將組織細(xì)胞分散成單個細(xì)胞？擴(kuò)大細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，利與細(xì)胞吸收營養(yǎng)。

10代以內(nèi)的細(xì)胞遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。

目前使用的或冷凍保存的正常細(xì)胞通常在10代以內(nèi)，為什么？動物細(xì)胞培養(yǎng)能否像綠色植物組織培養(yǎng)那樣最終培養(yǎng)成新個體？不能，動物細(xì)胞培養(yǎng)只能使細(xì)胞數(shù)目增多，不能發(fā)育成新的動物個體。1）無菌、無毒的環(huán)境：適宜的溫度：人和哺乳動物細(xì)胞最適溫度為36.5±0.5℃適宜的酸堿度：液體合成培養(yǎng)基：（葡萄糖、氨基酸）、促生長因子、（水、無機(jī)鹽、微量元素）等；通常還需加血漿、血清等天然成分。4）氣體環(huán)境：2）營養(yǎng)：3）溫度和pH：“95％空氣+5％CO2”的混合氣體培養(yǎng)箱。氧氣是細(xì)胞代謝必須的；CO2維持培養(yǎng)液的pH。對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具無菌處理；培養(yǎng)液中添加抗生素防止培養(yǎng)過程中污染；定期更換培養(yǎng)液以清除代謝產(chǎn)物，防止對培養(yǎng)細(xì)胞造成危害。動物細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是什么？較植物組培培養(yǎng)基有何獨(dú)特之處？主要成分：葡萄糖、氨基酸、水、無機(jī)鹽、維生素和動物血清等。獨(dú)特之處有：1.液體培養(yǎng)基2.成分中有動物血清等加入動物血清原因：提供一個類似生物體內(nèi)的環(huán)境；含營養(yǎng)物質(zhì)（如生長因子）促進(jìn)細(xì)胞發(fā)育。用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間物質(zhì)主要成分是什么？用胃蛋白酶行嗎？

在進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)時，用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。

動物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。如病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體主要用于作為受體細(xì)胞3.檢測有毒物質(zhì)，判斷某種物質(zhì)的毒性4.培養(yǎng)正?；蚋鞣N病變的細(xì)胞，用于細(xì)胞的生理、藥理、病理研究

如用于篩選抗癌藥物植物組織培養(yǎng)和動物細(xì)胞培養(yǎng)的比較比較項目植物組織培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)原理細(xì)胞的全能性細(xì)胞增殖培養(yǎng)基性質(zhì)固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖

動物血清培養(yǎng)結(jié)果植物體細(xì)胞株、細(xì)胞系培養(yǎng)目的快速繁殖、培育無病毒植株獲得細(xì)胞或細(xì)胞分泌蛋白取材植物幼嫩部分或花藥胚胎或幼齡動物的器官或組織其他條件無菌無毒，適宜條件無菌無毒，適宜條件

在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，下列哪種現(xiàn)象是不可能的（）A．細(xì)胞一直在細(xì)胞懸液中分裂生長B．有少部分細(xì)胞可能在培養(yǎng)條件下無限地傳代下去C．有部分細(xì)胞核型會發(fā)生變化D.個別細(xì)胞會發(fā)生基因突變A既然動物體細(xì)胞核仍具有全能性，為什么不能直接利用動物體細(xì)胞培育動物體？

想一想利用動物體細(xì)胞核移植技術(shù)動物細(xì)胞的全能性會隨著動物細(xì)胞分化程度的提高而逐漸受到限制，分化潛能逐漸變?nèi)酢Ｔ鯓硬拍苁箘游矬w細(xì)胞表現(xiàn)出全能性呢？1.定義：3.分類：2.原理：二、動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物

動物核移植是將動物的一個細(xì)胞的細(xì)胞核，移入一個已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中。使其重組并發(fā)育成一個新的胚胎，這個新的胚胎最終發(fā)育為動物個體。用核移植的方法得到的動物稱為克隆動物動物細(xì)胞核具有全能性胚胎細(xì)胞核移植、體細(xì)胞核移植胚胎細(xì)胞分化程度低，恢復(fù)其全能性相對容易動物體細(xì)胞分化程度高，恢復(fù)其全能性十分困難4.體細(xì)胞核移植的過程無性生殖供體：優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奶?！魹楹稳」w細(xì)胞傳代培養(yǎng)10代以內(nèi)的細(xì)胞？10代以內(nèi)的細(xì)胞一般保持正常二倍體的核型，未發(fā)生突變。

受體：普通奶牛（卵母細(xì)胞采集與培養(yǎng)）◆受體細(xì)胞為什么選用卵母細(xì)胞？

卵母細(xì)胞體積大，易操作；含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。

◆為什么必須先去掉卵母細(xì)胞的核◆為使核移植動物的遺傳物質(zhì)全部來自有利用價值的動物提供的細(xì)胞?！魹槭裁词褂萌ズ说臏p數(shù)第二次分裂中期細(xì)胞（MⅡ中期）？減數(shù)第二次分裂中期的卵母細(xì)胞才具有受精的能力，其內(nèi)含有生物生長發(fā)育的全部信息及營養(yǎng)，且有助于動物細(xì)胞核全能性的表達(dá)。因?yàn)樵谶@個時候去核的話對卵細(xì)胞損傷最小，距離很近，便于去核。

◆為什么不是取供體細(xì)胞核進(jìn)行核移植操作，而是直接將供體細(xì)胞整個注入去核卵母細(xì)胞中？保證供核不被破壞，使所得個體的性狀更符合供體?！艏せ罘椒ǎ骸艏せ钅康模骸舸偃诜椒ǎ弘姶碳?gòu)建重組胚胎◆胚胎移植至代孕受體內(nèi)

妊娠、分娩◆體細(xì)胞核移植方法生產(chǎn)的克隆動物是對體細(xì)胞供體動物進(jìn)行了100%的復(fù)制嗎？為什么？◆不是，克隆動物絕大部分DNA來自供體細(xì)胞核，但核外還有少部分DNA（如線粒體DNA）來自受體卵母細(xì)胞◆遺傳物質(zhì)基本相同供體細(xì)胞（供核）細(xì)胞培養(yǎng)體細(xì)胞卵巢卵母細(xì)胞（MⅡ中期：供質(zhì)）去核去核卵母細(xì)胞注入細(xì)胞融合重組細(xì)胞構(gòu)建重組胚胎胚胎移植代孕母體生出與供體奶牛遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛體細(xì)胞核移植的過程共分成兩大階段：核移植和胚胎移植受精卵體細(xì)胞核移植的原理：動物細(xì)胞核具有全能性卵細(xì)胞B母綿羊A母綿羊乳腺細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞核移植早期胚胎卵裂C母綿羊子宮胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育過程融合后的卵細(xì)胞黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核a重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利1.寫出ab所代表細(xì)胞工程名稱：a表示：

b表示：

2.實(shí)施細(xì)胞工程時，所需受體細(xì)胞大多采用卵母細(xì)胞的原因：體積大，易操作。含有促使細(xì)胞核表達(dá)全能性的物質(zhì)和營養(yǎng)條件。核移植胚胎移植黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核a重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利3.多利面部毛色是：

根據(jù)遺傳學(xué)原理說明判斷依據(jù)：4.若黑面綿羊的基因型為AA，白面綿羊的基因型為aa，則克隆羊的基因型為：

白色多利全部的核基因都來自白面綿羊aa細(xì)胞核具有全能性；細(xì)胞質(zhì)具有調(diào)控細(xì)胞核發(fā)育的作用。黑面綿羊去核卵母細(xì)胞白面綿羊乳腺細(xì)胞核a重組細(xì)胞電脈沖刺激早期重組胚胎b另一頭綿羊的子宮妊娠、出生克隆羊多利5.多莉羊的成功證明了什么？胚胎移植技術(shù)試管動物（嬰兒）培養(yǎng)過程卵細(xì)胞精子體外受精受精卵胚胎新個體母體子宮內(nèi)孕育、產(chǎn)出體細(xì)胞核移植流程：1.供體細(xì)胞的采集與培養(yǎng)（10代以內(nèi)）。5.用物理或化學(xué)方法激活受體細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育進(jìn)程。6.電刺激促融使供體核進(jìn)入受體卵母細(xì)胞，構(gòu)建重組胚胎。4.將供體細(xì)胞注入去核卵母細(xì)胞。3.顯微操作去除卵母細(xì)胞中的核。2.受體卵母細(xì)胞的采集與體外培養(yǎng)。7.胚胎移植入代孕母牛體內(nèi)。8.妊娠分娩與供體遺傳物質(zhì)基本相同的犢牛。5.體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景1.在畜牧業(yè)中可以加速家畜遺傳改良的進(jìn)程。2.保護(hù)瀕危物種。3.醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域：克隆動物作為生物反應(yīng)器，生產(chǎn)醫(yī)用蛋白；治療人類疾病，作為組織器官移植的供體。治療人類疾病，作為組織器官移植的供體主要的優(yōu)點(diǎn)是？不發(fā)生免疫排斥反應(yīng)◆研究克隆動物和克隆細(xì)胞更了解胚胎發(fā)育及細(xì)胞衰老過程；克隆動物做疾病模型，更好追蹤研究疾病的發(fā)展過程和治療疾病。6.體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題（1）成功率仍然非常低，產(chǎn)下的活克隆動物比率平均不到10%。（2）絕大多數(shù)克隆動物還存在健康問題，許多克隆動物表現(xiàn)出遺傳和生理缺陷，如體型過大，異常肥胖，發(fā)育困難，免疫失調(diào)等。（3）對克隆動物食品的安全性問題也存有爭議。

用于動物細(xì)胞培養(yǎng)的組織和細(xì)胞大都取自胚胎或出生不久的幼齡動物的器官或組織，其主要原因是這樣的組織細(xì)胞A.容易產(chǎn)生各種變異B.具有更強(qiáng)的全能性

C.取材十分方便D動物細(xì)胞培養(yǎng)要經(jīng)過脫分化？為什么？一般而言，動物細(xì)胞培養(yǎng)不需經(jīng)過脫分化過程。因高度分化的動物細(xì)胞發(fā)育潛能變窄，失去了發(fā)育成完整個體的能力，所以，動物細(xì)胞也就沒有類似植物組織或細(xì)胞培養(yǎng)時的脫分化過程了。要想使培養(yǎng)的動物細(xì)胞定向分化，通常采用定向誘導(dǎo)動物干細(xì)胞，使其分化成所需要的組織或器官。1、在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的細(xì)胞是

A．細(xì)胞系B．細(xì)胞株C．原代細(xì)胞D．傳代細(xì)胞2、動物細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)是A.動物細(xì)胞融合B.單克隆抗體ADA.培養(yǎng)基不同；B.動物細(xì)胞培養(yǎng)不需要在無菌條件下進(jìn)行；C.動物細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)，而植物細(xì)胞不能；D.動物細(xì)胞能夠大量培養(yǎng)，而植物細(xì)胞只能培養(yǎng)成植株。A知識結(jié)構(gòu)動物細(xì)胞培養(yǎng)和核移植技術(shù)動物細(xì)胞培養(yǎng)動物體細(xì)胞核移植技術(shù)和克隆動物核移植技術(shù)和克隆動物的概念體細(xì)胞核移植技術(shù)的過程體細(xì)胞核移植技術(shù)的應(yīng)用前景體細(xì)胞核移植技術(shù)存在的問題再見體細(xì)胞核移植的過程卵母細(xì)胞去核體細(xì)胞取核電刺激使兩細(xì)胞融合重組細(xì)胞重組胚胎新個體定義：人們通常將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。胰蛋白酶處理取出組織胚胎或幼齡動物器官組織剪碎單個細(xì)胞細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)（貼壁生長長成單層細(xì)胞。有接觸抑制現(xiàn)象）。①原代培養(yǎng)3.過程原代培養(yǎng)3、總結(jié)：動物細(xì)胞培養(yǎng)過程動物胚胎或幼齡動物的組織、器官配置細(xì)胞懸液剪碎用胰蛋白酶處理10代細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶40-50代細(xì)胞傳代培養(yǎng)無限傳代單個細(xì)胞加培養(yǎng)液稀釋傳代10代以內(nèi)，遺傳物質(zhì)不改變，保持正常二倍體核型。為什么用胰蛋白酶處理？分瓶傳代培養(yǎng)原代培養(yǎng)特點(diǎn)：細(xì)胞貼壁、