呼吸科痰和呼吸道分泌物標(biāo)本檢查技術(shù)操作規(guī)范

呼吸科痰和呼吸道分泌物標(biāo)本檢查技術(shù)操作規(guī)范第一節(jié)微生物學(xué)【概述】痰栝本采集方便，無創(chuàng)傷性，臨床應(yīng)用廣泛，對病原學(xué)診斷具有重要價值。痰標(biāo)本的正確采集、處理是臨床細(xì)菌檢驗(yàn)成功的關(guān)鍵，標(biāo)本釆集與處理的規(guī)范化是準(zhǔn)確、及時向臨床提供重要的感染信息的基礎(chǔ)。目前咳痰標(biāo)本仍是最常用、最簡單的采樣方法，必須指導(dǎo)或輔助患者深咳痰，及時送檢，并通過鏡檢篩選合格標(biāo)本。損傷性萊樣技木僅在選擇病例（抗生素治療反應(yīng)不佳；可疑特殊病原體感染，如寄生蟲、痰菌陰性肺結(jié)核、混合感染或二重感染等）使用?！静僮鞣椒ā?.咳痰標(biāo)本采集要求患者在清晨用藥前留取，因?yàn)槌刻盗慷?，且含菌量也多。留取前刷牙，用清水漱?次，以除去口腔內(nèi)大部分雜菌，之后用力晐痰。晐痰較困難者可用3%?5%氯化鈉溶液霧化蒸氣吸入進(jìn)行導(dǎo)痰;對咳嗽乏力或昏迷患者，可用普通吸痰管經(jīng)鼻腔或口腔吸引下呼吸道分泌物;對不能咳痰的嬰幼兒或病重患者，如須采集痰標(biāo)本做結(jié)核桿菌培養(yǎng)，可插胃管抽吸胃液標(biāo)本送檢，也可留取12?24h痰液，經(jīng)漂浮濃集后檢查，以提高結(jié)核桿菌檢出率。若做細(xì)菌或真菌培養(yǎng)，痰液必須盛于無菌容器內(nèi)送檢。觀察痰量應(yīng)留取24h痰液，必要時在容器內(nèi)加人央許防腐劑。2.咽拭子采樣上呼吸道感染，可通過咽拭子獲取標(biāo)本。標(biāo)本采集前數(shù)小時內(nèi)不得用消毒藥物漱口或涂抹病灶局部。用咽拭子采集標(biāo)本時應(yīng)小心、認(rèn)真、準(zhǔn)確，避免觸及舌、口腔黏膜和唾液，以防污染。如咽拭子標(biāo)本發(fā)現(xiàn)致病菌，如肺炎鏈球菌、流感桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等，且數(shù)量較多時、提示有該菌所致感染存在，3.纖維支氣管鏡抽吸采樣以利多卡因做咽喉部局部麻醉后，插入纖維支氣管鏡（纖支鏡），達(dá)到肺炎病灶引流支氣管內(nèi)，纖支鏡吸引口依次連接標(biāo)本采集瓶或試管及負(fù)壓吸引裝置，用負(fù)壓將下呼吸道分泌物經(jīng)纖支鏡吸入標(biāo)本采集瓶內(nèi)送檢。氣管切開或氣管插管患者也可用普通無菌吸痰管直接經(jīng)人工氣道插至大約葉支氣管水平，接負(fù)圧裝置將痰液經(jīng)吸痰管吸入標(biāo)本采集瓶內(nèi)。 纖支鏡直視下可準(zhǔn)確采集病灶部位的分泌物，但插入時纖支鏡頂端和內(nèi)孔常受咽喉部正常菌群污染，所以纖支鏡吸引物常規(guī)培養(yǎng)結(jié)糶不能完全代表肺部感染的病原體、但檢查過程中如注意規(guī)范化操作，插入纖支鏡時盡量不做上呼吸道分泌物吸引，纖支鏡吸痰遭口咽部細(xì)菌污染機(jī)會較咳痰明顯減少。一般認(rèn)為纖支鏡吸引物定盤培養(yǎng)可更有效地區(qū)分污染菌與感染菌。人工氣道是肺部感染的常見易感因素。經(jīng)人工氣道吸引下呼吸道分泌物是目前臨床較常用的標(biāo)本采集方法。但由于這些患者的氣管纖毛黏液防御機(jī)制受到損害，大氣道常有致病菌或條件致病菌定植而不再保持無菌狀態(tài)，故建立人工氣道患者肺部感染病原學(xué)診斷有時更為困難。通常認(rèn)為吸引物定量培養(yǎng)可能區(qū)分汚染菌抑或感染菌。根據(jù)國內(nèi)診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)人工氣道吸痰細(xì)菌濃度＞1X105cfu/ml可認(rèn)為是感染病原菌，而濃度＜1X10cfu/ml則認(rèn)為是污染菌。4.防污染標(biāo)本毛刷采樣防污染標(biāo)本毛刷（protectedspecimenbrush，PSB）一般經(jīng)纖支鏡采樣，咽喉部由利多卡因局部麻醉，纖支鏡插入至肺炎病灶引流支氣管腔內(nèi)，插入過程盡量不做吸引或向腔內(nèi)注射黏膜麻醉藥。PSB經(jīng)纖支鏡插入并超越前端1?2cm，伸出內(nèi)套管頂去聚乙二醇塞，越過外套管約2cm，隨后將毛刷仲出內(nèi)套管2?3cm刷取分泌物。毛刷、內(nèi)套管順序依次退回外套管內(nèi)，然后拔出整個PSB。PSB亦可經(jīng)人工氣道其至直接經(jīng)鼻腔插入釆樣，PSB插入前先在體外測量校度，估計PSB插至總支氣管或葉支氣管水時釆樣為宜。PSB經(jīng)人工氣道采集過程，.基本與經(jīng)纖支鏡采樣相同。采樣后的PSB用乙醇（酒精）消毒外套管，以無菌剪刀剪去內(nèi)、外套管頂端部分，然后，前伸毛刷并將其剪下至裝有無菌等滲氯化鈉液或乳酸林格液的試管內(nèi)，徹底振蕩使毛刷上的病菌洗滌混勻于液體中，送檢做定量細(xì)菌和真菌培養(yǎng)。此操作相對簡單，創(chuàng)傷輕微。有報道其特異性和敏感性分別達(dá)86%和89%.有學(xué)者認(rèn)為防污染標(biāo)本刷取樣應(yīng)深人，且多方向旋轉(zhuǎn)及上下移動，可提高培養(yǎng)的敏感性。5.支氣管肺泡灌洗術(shù)（bronchoalveolarlavage?BAL）采樣采用塑料導(dǎo)管，在近頂端處設(shè)置氣囊，纖支鏡插入病灶引流支氣管后，引人導(dǎo)管并楔人段支氣管然后用等滲氯化鈉液20?50ml分次注人，并立即用低負(fù)壓吸引回收，棄去首次灌洗液，以減少污染，收集以后回收的支氣管肺泡灌洗液（broneboalveolarlavageflu-ide.BALF）送檢。如果采用這種帶氣囊導(dǎo)管，在嵌人段支氣管后，注氣使氣囊膨脹填塞氣道。在局麻下施行BAL時，麻醉藥不能直接滴人灌洗的肺段，否則會抑制培養(yǎng)基中的細(xì)菌生長。BAL應(yīng)在胸片顯示的浸潤K或支氣管鏡檢見宥膿性分泌物的肺段進(jìn)行。獲取標(biāo)本后，應(yīng)盡快處理，以免被污染或使厭氣菌死亡。對于建人工氣道患者，可采用不經(jīng)纖支鏡的保護(hù)性支氣管肺泡灌洗（preventbronchoalve-olarlavage，PBAL）。BAL是一種診斷下呼吸道機(jī)會性感染的敏感方法，尤其適用于伴有免疫缺陷和免疫損傷者，其最理想的適應(yīng)證是疑有肺部感染而用其他非創(chuàng)傷性檢查方法不能明確病原學(xué)診斷者。BAL是診斷肺部寄生蟲感染的最有效的方法，若BALF中有陽性發(fā)現(xiàn)則可診斷為寄生蟲感染。BAL診斷蕕得性免疫缺陷綜合征（艾滋?。┗颊咧锌ㄊ戏捂咦酉x肺炎的敏感性為85%?90％。如從患者的BALF中分離出較高濃度真菌，則應(yīng)高度懷疑肺部真菌感染。一些研究表明，若BALF中發(fā)現(xiàn)有病毒生長，也可診斷為肺部病毒感染。BAL也可用于診斷細(xì)菌性肺炎，如在患者的BALF中分離出結(jié)核桿菌和軍團(tuán)歯，具有確診價值。BALF的半定量培養(yǎng)對細(xì)菌性肺炎的診斷意義較大，但BALF也可被口咽部分泌物污染，檢査及評價結(jié)果時均應(yīng)予以注意。BAL并發(fā)癥罕見，偶可致呼吸衰竭、肺炎、氣胸、咯血等。與肺活檢相比，相對安全?！咀⒁馐马棥?.標(biāo)本的運(yùn)送與保存痰標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢，爭取在20min內(nèi)送到細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室。痰液室溫下延擱2?5h會降低肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌的檢出率，而定植于上呼吸道的非致病菌和革蘭陰性桿菌會過度生長。另外，細(xì)菌室收到標(biāo)本后應(yīng)立即進(jìn)行標(biāo)本的質(zhì)量檢査、處理及培養(yǎng)接種，如不能立即進(jìn)行檢查，則應(yīng)暫吋放于冰箱中，冰箱中存放的標(biāo)本應(yīng)在24h以內(nèi)進(jìn)行檢查。2.標(biāo)本的質(zhì)量檢查雖然部分痰標(biāo)本通過肉眼觀察其外觀如黏液和膿性成分，可大致了解受檢標(biāo)本的質(zhì)量，但僅憑此點(diǎn)尚嫌不足，研究發(fā)現(xiàn)，痰涂片革蘭染色做細(xì)胞學(xué)檢査判斷痰標(biāo)本受污染程度是一種較為可靠的方法。一般認(rèn)為，來自下呼吸道的合格的痰標(biāo)本應(yīng)是含白細(xì)胞和支氣管柱狀上皮細(xì)胞較多；而受唾液污染嚴(yán)重的不合格標(biāo)本則來自頰黏膜的扁平鱗狀上皮細(xì)胞較多。痰標(biāo)本在培養(yǎng)之前首先必須對其質(zhì)量進(jìn)行估評，其方法是做涂片，用革蘭染色鏡檢。在顯微鏡（10X10）下觀察白細(xì)胞和扁平上皮細(xì)胞存在的情況，每低倍光鏡視野痰鱗狀上皮細(xì)胞＞25個時，不管白細(xì)胞數(shù)量如何，均可視為不合格標(biāo)本6目前，一般主張?zhí)抵苯油科忡R檢查毎低倍視野鱗狀上皮細(xì)胞＜10個、白細(xì)胞＞25個，或鱗狀上皮細(xì)胞：內(nèi)細(xì)胞＜1：2.5，可做污染相對較少的“合格”標(biāo)本接種培養(yǎng)。在粒細(xì)胞缺乏者不宜用單純白細(xì)胞數(shù)作為評價指標(biāo)，而應(yīng)以涂片中見到柱狀上皮細(xì)胞或錐狀上皮細(xì)胞與白細(xì)胞并存為合格標(biāo)本指標(biāo)。3.標(biāo)本接種前處理(1)標(biāo)本的洗凈：由于痰中含有正常菌群影響病原菌的檢出，采用以下方法可以減少正常菌群。將痰液加人含有15?20ml滅菌的生理鹽水的試管中，劇烈振蕩5?10s，然后用接種環(huán)將沉淀于管底的膿痰小片沾出，再放人一個試管內(nèi)，以同樣的方法反復(fù)2次，最后將剩余的膿痰接種于培養(yǎng)基上。(2)標(biāo)本均質(zhì)化：痰均質(zhì)化以胰酶均質(zhì)化為多見。其方法為向痰液內(nèi)加人等量的pH為7.6的10%胰酶溶液，放置37攝氏度40分鐘，即能使痰均質(zhì)化，而對細(xì)菌培養(yǎng)無較大影響。(3)標(biāo)本消化-去污染處理法：此方法的標(biāo)本用于結(jié)核桿菌培養(yǎng)。方法是將二硫蘇糖醇與痰液等量置離心管內(nèi)，攪拌后劇烈振蕩，再靜止15min，加人無菌、濃度0.067moI/L.pH為6.8的磷酸鹽緩沖液至離心管口12cm處，關(guān)緊蓋，顛倒至少3次，3OOOr/min離心lSmin，保留沉淀物，用火焰通過管口，加人1?2ml的20g/L牛血清清蛋白(白蛋白)溶液，以手搖混合，用此沉淀物制涂片并接種培養(yǎng)基。第二節(jié)痰液細(xì)胞學(xué)檢查【概述】痰脫落細(xì)胞學(xué)檢查是診斷某些呼吸系統(tǒng)疾病的重要方法。方法簡便，且不給病人帶來任何痛苦，可反復(fù)檢査。尤其診斷肺癌陽性率可達(dá)80%以上，其中診斷小細(xì)胞肺癌陽性率90%、鱗癌陽性率82.2%、腺癌陽性率69.4%.未分化癌陽性率71.4%，診斷假陽性率1.8%。中心型肺癌陽性率高于周邊型肺癌，分別為82.9%和62.8%0痰細(xì)胞學(xué)檢查也可作為判斷治療療效或早期復(fù)發(fā)的指標(biāo)之一。但傳統(tǒng)的痰細(xì)胞學(xué)檢查易受取材、保存、制片、染色及檢查人員素質(zhì)等因素的影響，靈敏度僅為20%?30%，因此，改進(jìn)痰細(xì)胞學(xué)的檢査方法是非常重要和必須的?！静僮鞣椒ā?.痰標(biāo)本采集。要求患者清晨收集肺深部咳出的痰。醫(yī)務(wù)人員必須認(rèn)真指導(dǎo)患者如何從肺深部咳痰，咳痰前不能吃任何東西，最好先用清水漱口3次，以去除口腔雜物。之后做2?3次深呼吸，再用力唆嗽，將肺深部的痰咳出，遺棄第1口痰，留第2、3、4口痰做標(biāo)本。如患者咳痰困難，可用3%?5%氯化鈉溶液霧化吸入，誘導(dǎo)痰液排出。目前多數(shù)醫(yī)院痰留置于干凈的玻璃器內(nèi)，或置于95%乙醇內(nèi)。留置器皿內(nèi)的痰應(yīng)于1?2h內(nèi)送化驗(yàn)室。如不能及時送檢，則必須保存在VC冰箱內(nèi)。徐片要由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)員進(jìn)行，選擇帶血絲的痰或灰白色痰塊涂片，涂片要均勻，并立即置于固定液內(nèi)，再用巴氏或蘇木素和伊紅(hematoxylinandeosin，、HE)染色。置于乙醇的痰標(biāo)本可送病理科，進(jìn)行石蠟包埋后染色。2.痰液收集方法已有很快進(jìn)展，1963年Saccomanno建立了保存痰液的方法，已被廣泛應(yīng)用于臨床及肺癌篩查中。2000年協(xié)和醫(yī)院對Saccomanno法進(jìn)行了相應(yīng)改良，加人了解黏劑，使細(xì)胞學(xué)檢查陽性率有明顯提高。但長期保存有17.7%標(biāo)本受損。我院痰儲存固定常用50%乙醇和2%多聚乙醇的混合液。每個收集管內(nèi)置固定液20ml，可留取7?8口痰，便于進(jìn)行多項目檢查。已留痰的收集管立即保存于4攝氏度冰箱。解黏處理這一步非常重要，否則將收集不到純脫落細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)及痰基因分析，目前解黏處理常用美國PROMEGA公司生產(chǎn)的DTT(DL-Dithiothreitol)，工作濃度為5%，DTT可打斷黏蛋白之間的二硫鍵連接，而不損傷細(xì)胞。20世紀(jì)90年代中期發(fā)展的液基細(xì)胞學(xué)與計算機(jī)輔助細(xì)胞學(xué)診斷系統(tǒng)(CCT)的應(yīng)用，可使痰細(xì)胞學(xué)檢出的陽性率達(dá)97.1%。液基細(xì)胞學(xué)包括薄層細(xì)胞學(xué)檢測系統(tǒng)(TCT)和自動細(xì)胞學(xué)檢測系統(tǒng)(LCT)，均已獲美國FDA批準(zhǔn)，應(yīng)用于臨床?？蓪⑻禈?biāo)本中的黏液、血液和炎性細(xì)胞分離，收集痰脫落細(xì)胞制成薄片，用于細(xì)胞學(xué)檢測，使痰的采集、制片、染色等步驟實(shí)現(xiàn)標(biāo)淮化和自動化，并應(yīng)用計算機(jī)技術(shù)，對痰涂片給予分析，提高丁精確度。3.留取痰次數(shù)。一般認(rèn)為送檢4~6次，據(jù)報道1、2、3、4次的陽性率分別為47.2%、72.7%、84.5%、91.5%。當(dāng)晚期中心型肺癌支氣管完全阻塞或合并氣道感染時，腫物表面有多量壞死物及膿痂，痰細(xì)胞學(xué)往往呈陰性，待抗炎、化學(xué)治療或放療后，氣道稍通暢，繼續(xù)不斷多次留痰，有可能得到細(xì)胞學(xué)陽性診斷。4.痰檢肺癌相關(guān)基因的分子生物學(xué)。目前痰脫落細(xì)胞分子生物學(xué)檢査有廣闊的發(fā)展前途，北京協(xié)和醫(yī)院已進(jìn)行免疫標(biāo)記技木在肺癌篩查中應(yīng)用研究。(1)不均一核糖蛋白(heterogeneousnuclealribonucleoprotein，hnRNP)A2/B1：是一種RNA結(jié)合蛋白，在肺癌組織中表達(dá)增高，痰脫落細(xì)胞陽性者表達(dá)為57%。肺癌高危人群監(jiān)測中已證實(shí)，痰脫落細(xì)胞呈鱗狀化生和不典型增生時有hnRNP表達(dá)。國外報道肺癌病人在臨床確診前2年收集的痰標(biāo)本中已有hnRNPA^B：陽性表現(xiàn)。(2)痰P53基因突變測定：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(