液相色譜-手性分析條件的建立和優(yōu)化

1/79手性分析條件的建立和優(yōu)化手性分析中的本卷須知Daicel手性色譜柱一覽表2/79正相直鏈淀粉衍生物

CHIRALPAK?

AD/AD-H

CHIRALPAK?

AS/AS-H纖維素衍生物

CHIRALCEL?

OD/OD-H

CHIRALCEL?OJ/OJ-H

CHIRALCEL?

OA,OB,OC

CHIRALCEL?

OF,OG,OK

CHIRALCEL?

CA-1反相

CHIRALPAK?

AD-RH

CHIRALPAK?

AS-RHCHIRALCEL?

OD-RH

CHIRALCEL?

OJ-RH其它

CROWNPAK?

CR(＋),(－)

CHIRALPAK?

OT(＋),OP(＋)

CHIRALPAK?

WH,MA(＋)CHIRALPAK

?

QD-AXCHIRALPAK?

QN-AX共價(jià)鍵合型－新產(chǎn)品

CHIRALPAK?

IA

CHIRALPAK?

IB第二代手性色譜柱3/79<特性> 1)5微米硅膠用于獲得高的理論塔板數(shù)

2)適用于痕量分析

3)采用15cm長(zhǎng)的手性柱可節(jié)省分析時(shí)間2)H系列手性柱CHIRALPAK?AD-H CHIRALCEL?OD-HCHIRALPAK?AS-H CHIRALCEL?OJ-H9/47－－H系列ASvs.AS-H(中性組分)ASAS-H?柱尺寸：0.46cmI.D.x25cmL?樣品：trans-Stilbeneoxide?條件

流動(dòng)相：正已烷/異丙醇=90/10

流量：1.0ml/min.

溫度：25°C

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV254nm1.6times0.01.02.03.04.05.06.0mV0.02.04.06.08.0Minutes4.154.480.01.02.03.04.05.06.0mV0.02.04.06.08.0Minutes4.515.0010/472)H系列手性柱ASvs.AS-H(堿性組分)ASAS-H?柱尺寸：0.46cmI.D.x25cmL?樣品：1-[5-Chloro-2-(methylamino)phenyl]- 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline?條件

流動(dòng)相：正已烷/異丙醇/二乙胺=90/10/0.1

流量：1.0ml/min.

溫度：25°C

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV254nm3.4times02468101214mV0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0Minutes4.354.7802468101214mV01.02.03.04.05.06.07.08.09.0Minutes4.485.1611/472)H系列手性柱ASvs.AS-H(酸性組分)ASAS-H?柱尺寸：0.46cmI.D.x25cmL?樣品：2-(4-Hydroxyphenoxy)丙酸?條件

流動(dòng)相：正已烷/異丙醇/三氟乙酸=90/10/0.1

流量：1.0ml/min.

溫度：25°C

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV254nm010203040mV0481216202428Minutes15.3817.86010203040mV0481216202428Minutes11.5512.452.1times2)Hseriescolumns12/47-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.350.40mV6.06.57.07.58.08.59.0Minutes6.968.06OJvs.OJ-H(痕量分析)?柱尺寸：0.46cmI.D.x25cmL?樣品：1-Phenylethanol?條件

流動(dòng)相：正已烷/異丙醇＝90/10

溫度：25°C

流量：1.0ml/min.

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV254nmOJOJ-H－－＋-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.350.40mV6.06.57.07.58.08.59.0Minutes7.007.88＋痕量分析

0.5％手性化合物13/472)H系列手性柱?柱尺寸：0.46cmI.D.×25cmL?樣品：2-Phenyl丙酸?條件

流動(dòng)相：正已烷/異丙醇/TFA=80/20/0.1

溫度：25°C

流量：1.0ml/min.

檢測(cè)波長(zhǎng)：UV254nmADvs.AD-H(痕量分析)ADAD-H痕量分析

0.5％手性化合物－-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50mV3.84.04.24.44.64.85.05.25.4Minutes4.354.75＋－-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50mV3.63.84.04.24.44.64.85.05.25.4Minutes4.214.47＋14/472)H系列手性柱9/79*ChiralCrownEthercoatedonsilica*Foraminoacids(primaryaminogroupnearthechiralcenter)*DipeptidesCROWNPAK

CR(+)冠醚性手性色譜柱CROWNPAKCR(+)的拆分實(shí)例10/79AminoacidsKD’aRspHFlowrate(ml/min.)Temp.AminoacidsKD’aRspHFlowrate(ml/min.)Temp.Alanine0.381.863.171.50.425Cysteine0.441.673.311.50.425Valine1.091.513.471.50.40Tyrosine2.881.282.472.00.825Norvaline0.691.692.742.00.825Asparagine0.531.693.151.50.40Leucine1.441.673.732.00.825Glutamine0.252.133.112.00.425Norleucine1.761.663.382.00.825Asparadicacid0.612.014.072.00.40Isoleucine1.761.584.292.00.40Gultamicacid0.332.815.322.00.425tert-leucine2.061.100.701.00.40Ornithine0.651.492.821.50.425Phenylalanine3.881.272.802.00.825Lysine1.181.262.201.50.425DOPA2.021.322.622.00.825Arginine0.652.215.181.50.825Methionine1.052.005.872.00.825Citruline0.432.183.971.50.425Ethionine2.431.936.032.00.825Proline0.731.00---1.50.40Phenylglycine1.062.357.142.01.040Histidine0.901.825281.50.40Serine0.481.753.041.50.40Tryptophan18.451.192.222.1.225Threonine0.392.584.202.00.40ResolutionofAminoacidsonCROWNPAKCR(+)11/79第三代手性色譜柱CHIRALPAK?

IA,IBCHIRALPAK?

IA與IB研發(fā)背景12/79涂敷型

正相:正己烷,異丙醇,乙醇

反相:水,乙腈,甲醇,乙醇,異丙醇在廣泛的流動(dòng)相條件下具有很強(qiáng)的手性別離能力色譜試驗(yàn)過(guò)程中，用于溶解樣品的溶劑沒(méi)有任何限制在各種溶劑中柱性能異常穩(wěn)定鍵合型CHIRALPAK?

IA,CHIRALPAK?

IBCHIRALPAK?IA,IB的根本特征13/79

規(guī)格

:150或

250X4.6mmID,250X10或

20mmID

柱溫

:0to40oC

柱壓

:10MPanR=CHIRALPAK?IA載體

:硅膠手性選擇劑

:直鏈淀粉-

三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)

R=CHIRALPAK?IB載體

:硅膠手性選擇劑

:纖維素-

三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)

n14/79CHIRALPAK?IA柱應(yīng)用實(shí)例不同流動(dòng)相體系下手性別離methaqualone

024681012

50100150200250300=2.81MtBE/EtOH95:5010200.000.010.020.030.040.05n-hexane/CH2Cl275:25=2.36=1.960123456789101112131400.10.20.3toluene/n-hexane/EtOH70:25:5024681012140.00.20.40.60.81.0=1.79n-hexane/CHCl350:50010200.000.010.020.030.04=1.70n-hexane/methylacetate80:2002468101214050100150200250=1.65n-hexane/2-PrOH80:20010200.00.10.2=1.63n-hexane/THF85:15=1.33024681012140.00.20.40.60.81.0n-hexane/acetone85:1519/2115/79IA,IB柱的修復(fù)再生修復(fù)再生后（可使用各種強(qiáng)極性溶劑）柱性能受損（如受強(qiáng)吸附雜質(zhì)的影響）流動(dòng)相:n-hexane/EtOH90/101ml/min,25°C樣品新色譜柱20/21CHIRALPAK?IA別離實(shí)例

---中性樣品--16/790123456789010203040甲基叔丁基醚=100k1’=0.31,

=2.94Hexobarbital0246810121416180.00.20.40.60.8Lorazepam正己烷/丙酮=60/40k1’=1.75,

=1.470246810121416180.00.20.40.60.81.0正己烷/1,4-二氧環(huán)乙烷=70/30k1’=1.65,

=2.19Glutethimide02468101214161820222426280.000.020.040.060.080.10正己烷/二氯甲烷=25/75k1’=3.93,

=1.524-Benzoyloxy-2-azetidinoneCHIRALPAK?IA別離實(shí)例

---堿性樣品---17/79051015202530350.00.10.20.30.40.50.60.70.8Hex/THF/DEA=90/10/0.1k1’=3.94,

=1.55Bupivacaine02468101214161820222426280.000.050.100.150.20Hex/EtOAc/DEA=40/60/0.1k1’=2.90,

=2.22Hydroxyzine02468101214161820222426280.00.10.20.30.4Hex/Acetone/DEA=80/20/0.1k1’=3.36,

=1.37Disopyramide0246810050100150200MTBE/EtOH/DEA=80/20/0.1k1’=0.67,

=1.75IndapamideCHIRALPAK?IA別離實(shí)例

---酸性樣品---18/79024681012141618200.00.20.40.60.81.0Hex/EtOAc/TFA=70/30/0.1k1’=2.83,

=1.18Suprofen01234567891011121314150.00.20.40.60.81.0Hex/EtOH/TFA=85/15/0.1k1’=0.74,

=1.37Flurbiprofen01234567891011121314150.00.10.20.30.40.50.60.0MeOH/EtOH/TFA=50/50/0.1k1’=0.59,

=1.45Sulindac0123456789100.000.050.100.150.200.250.30Hex/THF/TFA=65/35/0.1k1’=1.01,

=1.14TropicacidCHIRALPAK?IB別離實(shí)例

---中性樣品--19/79正己烷/三氯甲烷=50/50

=1.12正己烷/二氯甲烷=80/20k1’=0.69,

=1.62正己烷/四氫呋喃=90/10k1’=2.28,

=2.26Mephobarbital

trans-Stilbeneoxide2,2,2-Trifluoro-1-(9-anthryl)ethanol02468101214MinutesCHIRALPAK?IB別離實(shí)例

---堿性樣品--20/79正己烷/THF/EDA=70/30/0.1k1’=0.67,

=2.68正己烷/CHCl3/EtNA=65/35/0.1k1’=1.20,

=1.33MTBE/EtOH/EDA=95/5/0.1k1’=0.45,

=2.98LaudanosineTerfenadineOxprenolol68Minutesmin246802468MinutesCHIRALPAK?IB別離實(shí)例

---酸性樣品--21/79正己烷/乙酸乙酯/TFA=70/30/0.1k1’=2.69,

=1.59WarfarinN-Benzyloxycarbonyl-valine正己烷/CHCｌ３/甲醇/TFA=70/30/1/0.1k1’=1.52,

=1.1422/79離子交換型新手型色譜柱維也納大學(xué)W.Lindner教授研究開(kāi)發(fā)的離子交換型手性色譜柱不對(duì)稱(chēng)炭原子臨近的胺正離子和酸性官能基〔X-)所形成的不對(duì)稱(chēng)環(huán)境是手性化合物別離的根本作用力手性識(shí)別劑Quinine衍生物

ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ?

QN-AX：(8S,9R)

Quinidine衍生物ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ?

QD-AX：(8R,9S)

23/79N-保護(hù)氨基酸的分析實(shí)例

CHIRALPAK?QD-AXMeOH/AcOH=100/1(v/v)N-Ac-AlaN-Ac-SerCHIRALPAK?QD-AXMeOH/AcOH=97/3(v/v)N-Boc-LeuCHIRALPAK?QN-AXMeOH/AcOH=100/1(v/v)7.79.54.75.67.69.5內(nèi)容提綱24/791.手性HPLC分析條件的建立和優(yōu)化1-1正相色譜2-2反相色譜2.手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.手性分析中的本卷須知4種主要的正相柱和反相柱25/79正相反相普通H系列CHIRALCEL?

系列ODOD-HOD-RHOJOJ-HOJ-RHCHIRALPAK?系列ADAD-HAD-RHASAS-HAS-RH柱長(zhǎng)25cm25cmN.A.(I.D.:0.46cm)N.A.15cm15cmR=R=nnR=R=15/21分析條件優(yōu)化流程圖(1)26/79酸性中性堿性1.流動(dòng)相中添加物的必要性配制流動(dòng)相Hex/IPA/TFA=90/10/0.1Hex/IPA/DEA=90/10/0.1Hex/IPA=90/10樣品添加物在別離中的作用27/79堿性樣品mVMinutes0.01.02.03.04.05.06.07.002468101214161820222410.7413.96Hex/IPA/DEA=90/10/0.1流量：1.0mi/min.溫度：25℃、檢測(cè)波長(zhǎng)：ＵＶ〔254ｎｍ〕流動(dòng)相

Hex/IPA=90/10Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1流動(dòng)相

Hex/IPA=90/10-0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35mV024681012141618202224262830Minutes10.940.40流量：1.0mi/min.溫度：40℃、檢測(cè)波長(zhǎng)：ＵＶ〔254ｎｍ〕05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52Minutes0.00.20.40.60.81.01.21.41.6mV0510152025303540酸性樣品〔沒(méi)出峰)〔無(wú)法別離)添加物的種類(lèi)和用量樣品酸堿性添加物種類(lèi)添加量中性不需要堿性二乙胺

(DEA)(n-丁胺*1)(乙醇胺*2)≦0.5％通常0.1％酸性三氟乙酸

(TFA)醋酸≦0.5％通常0.1％28/79*1主要用于1級(jí)胺*2主要用于1級(jí)氨基醇分析條件優(yōu)化流程圖(2)29/79保存時(shí)間?長(zhǎng)適宜的分析時(shí)間(10-30min.)短增加

異丙醇增加正已烷2.配制好流動(dòng)相選擇適宜的手性柱分析分析條件優(yōu)化流程圖〔3〕30/79沒(méi)有別離局部別離3.選擇適宜的手性柱嘗試別的手性柱OK!基線(xiàn)別離繼續(xù)優(yōu)化分析條件別離？篩選結(jié)果31/790510152025303540455055600123456789101112131415Minutes4.684.82OB15mV1234567891011121314Minutes6.716.87OD05101520253035404550556065mV0-505101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52AD05101520253035404550556065mV0123456789101112131415OJmV01020304050607080mV012345678910111213144.7090AS1501020304050607080901000123456789101112131415Minutes4.70OCMinutes1020304050607080mV0123456789101112131415Minutes4.3615OGMinutes001020304050607080mV01234567891011121314Minutes4.36OF色譜條件流動(dòng)相：

Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1流量 ：1.0ml/min.溫度 ：40℃檢測(cè)波長(zhǎng) ：UV254nm樣品 ：先擇效果最好的手性柱,然后繼續(xù)優(yōu)化分析條件分析條件優(yōu)化流程圖〔4-A〕32/79局部別離A.降低異丙醇濃度

B.調(diào)整溫度C.更換醇類(lèi)4.分析條件繼續(xù)優(yōu)化醇濃度的影響33/7905101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52在多數(shù)情況下，降低醇的濃度可延長(zhǎng)保持時(shí)間，改善別離度Column：AD,Temp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1Hex./IPA/AcOH=100/1/0.1-0.50.00.51.01.52.02.53.03.5mV051015202530354045505560Minutes35.7743.71Sample：Flurbiprofen分析條件優(yōu)化流程圖〔4-B〕34/79局部別離B.調(diào)整溫度C.更換醇類(lèi)4.分析條件繼續(xù)優(yōu)化A.降低異丙醇濃度溫度的影響35/79Column：CHIRALPAKADMobilephase：Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1,Flowrate：1.0ml/min.25℃40℃Temp.：

5℃降低柱溫可增大α值，但會(huì)使峰形變寬升高柱溫會(huì)減少α值，但會(huì)使峰形尖鋒-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.00123456789101112131415Minutes8.7212.13α:1.59mVMinutes0510152025303501234567891011121314156.667.52α:1.23mV01234567890123456789101112131415Minutes7.669.12α:1.32分析條件優(yōu)化流程圖〔4-C〕36/79局部別離C.更換醇類(lèi)B.調(diào)整溫度4.分析條件繼續(xù)優(yōu)化A.降低異丙醇濃度醇種類(lèi)的影響37/79Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1IPA和EtOH有時(shí)會(huì)使峰形和α值發(fā)生明顯變化Column：CHIRALPAKAD

Temp.：40℃,Flowrate：1.0ml/min.Sample：Flurbiprofen05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52a=1.2305101520253001234567891011121314157.589.64a=1.45mVMinutesHex./EtOH/AcOH=95/5/0.1正相柱分析條件優(yōu)化的總結(jié)38/79根據(jù)樣品性質(zhì)判斷是否需要往流動(dòng)相中加添加物調(diào)整正己烷/醇的比例，從而選擇適當(dāng)?shù)谋４鏁r(shí)間其它優(yōu)化方法流動(dòng)相的醇濃度降低醇的濃度能改善別離度，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間色譜柱溫度降低柱溫能增加α值，但會(huì)使峰形變寬流動(dòng)相中醇的種類(lèi)改換醇的種類(lèi)(IPA?EtOH)，有時(shí)會(huì)使選擇性發(fā)生一些變化內(nèi)容提綱39/791.手性色譜柱分析條件的建立和優(yōu)化2-1正相色譜2-2反相色譜手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.手性分析中的有關(guān)本卷須知RH系列〔反相用〕的規(guī)格流動(dòng)相耐壓(MPa)溫度范圍(℃)pH范圍OD-RH水溶液/有機(jī)溶劑*1=90/10~0/100105～402～7OJ-RHAS-RH5～40*22～9*2,3AD-RH40/79*1有機(jī)溶液：醇〔甲醇，乙醇，異丙醇〕或乙腈*2pH＞7使用時(shí)，溫度在5～25℃*3pH超過(guò)8時(shí)，使用硼酸緩沖液根據(jù)樣品性質(zhì)選擇流動(dòng)相樣品性質(zhì)OD-RH、OJ-RHAD-RH、AS-RH中性水/乙腈酸性磷酸水溶液(pH2)/乙腈0.1M磷酸緩沖液(pH2)/乙腈堿性0.1MKPF6

水溶液/乙腈0.1MNaPF6水溶液/乙腈20mM硼酸緩沖液(pH9)/乙腈20mM磷酸緩沖液(pH8)/乙腈41/79反相流動(dòng)相的pH值對(duì)別離度的影響(AS-RH)42/79中性化合物Benzoin酸性化合物N-CBZ-Norvaline堿性化合物Ofloxacinethylester水溶液水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=80/20流速：0.5ml/min.051015mV02468101214Minutes7.168.77024681012mV012345678910Minutes2.250.01.02.03.04.0mV051015202530354045505560Minutes27.79水磷酸水溶液(pH2)硼酸緩沖液(pH9)051015mV02468101214Minutes7.118.7005101520mV0.02.04.06.08.0Minutes4.174.69020406080mV051015202530354045505560Minutes4.004.484.77051015mV02468101214Minutes6.978.53010203040506070mV012345678910Minutes1.850.02.04.06.08.0051015202530354045505560Minutes30.7436.78有機(jī)溶劑種類(lèi)對(duì)別離的影響43/79水/乙腈=50/50水/乙醇=35/65水/甲醇=25/752-Methyl-1-tetralone2-Phenyl-2-butanol

手性柱：CHIRALPAKAD-RH、流速：0.5ml/min、溫度：25℃反相柱分析條件優(yōu)化的總結(jié)44/79根據(jù)樣品性質(zhì)選擇流動(dòng)相※中性，酸性樣品對(duì)4種反相柱的流動(dòng)相是一致的。但是，堿性樣品對(duì)OD-RH、OJ-RH的流動(dòng)相和AD-RH、AS-RH的流動(dòng)相是不同的。探索適當(dāng)?shù)谋４鏁r(shí)間和流動(dòng)相組成其它優(yōu)化條件水溶液和有機(jī)溶液比例多數(shù)情況下降低有機(jī)溶液的濃度能改善別離，但會(huì)延長(zhǎng)分析時(shí)間。色譜柱溫度降低柱溫能增加α值，但會(huì)使峰形變寬。有機(jī)溶劑的種類(lèi)有機(jī)溶劑的種類(lèi)不同，其洗脫強(qiáng)度也不同。有時(shí)其別離效果也發(fā)生一些變化內(nèi)容提綱45/791.手性色譜柱分析條件的建立和優(yōu)化2-1正相色譜2-2反相色譜2.手性色譜柱的自動(dòng)篩選3.手性分析中的本卷須知手性色譜柱組合篩選46/79手性色譜柱組合

CHIRALPAK

?AD-HCHIRALPAK?AS-HCHIRALCEL?OD-HCHIRALCEL?OJ-H

手性色譜柱尺寸：

0.46cmI.D.×15cmL為何選用AD-H,AS-H,OD-H,OJ-H這4種柱子？47/79２０００～２００４年

客戶(hù)樣品分析６６０個(gè)樣品的分析結(jié)果到達(dá)基線(xiàn)別離的手性柱比例：基線(xiàn)別離８０%〔524〕局部別離10%〔63〕不別離10%〔73〕AD系列、OD系列、AS系列、OJ系列92%〔482樣品〕其他8%〔42樣品〕為何選用15cm長(zhǎng)度手性色譜柱呢？48/79標(biāo)準(zhǔn)條件柱長(zhǎng)〔15／25〕×流速〔1／3〕＝分析時(shí)間短縮為〔1／5〕組合篩選設(shè)備49/79?????IPA????50/79組合篩選設(shè)備示意圖泵紫外檢測(cè)器色譜柱自動(dòng)切換閥流動(dòng)相2自動(dòng)進(jìn)樣器流動(dòng)相1溶劑切換閥旋光檢測(cè)器串聯(lián)旋光檢測(cè)器的