水華束絲藻粗提物對小鼠血液生物力學(xué)的影響

水華束絲藻粗提物對小鼠血液生物力學(xué)的影響

近年來，赤潮發(fā)生在世界附近的靠海海域。赤潮生物產(chǎn)生的海上毒素通過海上食物網(wǎng)絡(luò)而導(dǎo)致各種貝類、魚類、鳥類和沿海居民的家人、家人和家人，造成巨大的海洋經(jīng)濟損失。而各種海洋生物的食用價值日愈為人們所認可,逐漸進入普通家庭,越來越多的人也進入這一毒素食物網(wǎng),人們誤食有毒貝類而死亡的報道已屢見不鮮。在這些海洋毒素中,麻痹性貝毒可說是最常見、危害也最大的一種。麻痹性貝毒是石房蛤毒素(Saxitoxin,STX)及其衍生物共20多種毒性、毒量均不同的毒素的統(tǒng)稱,它們的毒理是相同的,只是毒性有差異。在這些毒素中,STX和新石房蛤毒素(neo-STX)較為穩(wěn)定,且毒力較高;而膝溝藻毒素(GTX)等在一定的溫度和酸度條件下較易發(fā)生轉(zhuǎn)化,且毒性比前兩者弱,故不利于毒素的研究。藍藻水華束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)是一種較易培養(yǎng)的淡水藻,其所分泌的麻痹性貝毒主要是STX毒素和neo-STX毒素,且含量很高,適于作麻痹性貝毒研究的毒素材料來源。目前,國內(nèi)外學(xué)者在STX對動物心血管和血壓的作用等方面做過不少的研究報道。為了保持毒性,麻痹性貝毒一般都在酸性條件下提取和保存,以及在酸性條件下進行毒力測定。所以,研究毒素和酸對動物的毒性作用關(guān)系有其必要性。本文就STX和酸性生理鹽水對小白鼠血液若干生理指標的影響進行初步的探討,以便為STX中毒的診斷和防治提供幫助,并為今后的進一步研究打下基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面水華束絲藻由暨南大學(xué)水生生物研究所提供。健康無孕、18~22克左右的雌性昆明小白鼠購自暨南大學(xué)實驗動物廠。1.2方法1.2.1培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)程序培養(yǎng)基采用Mahmood所采用的BG-11培養(yǎng)基。5L血清瓶,以氣泵通空氣,每天搖瓶1次。培養(yǎng)溫度24℃~25℃,培養(yǎng)瓶表面光強在培養(yǎng)初期為70~90μmol/(m2·s)后期為150~200μmol/(m2·s)。培養(yǎng)20天后離心收集藻細胞。1.2.2提取毒素細胞經(jīng)離心收集后,加0.1mol乙酸,凍融4次,然后離心得上清液,作為毒素粗提液。1.2.3小鼠毒副反應(yīng)總毒素含量ld50采用AOAC小鼠生物檢測法。腹腔注射1ml適當稀釋的粗提物,使小鼠死亡時間為5~7min,然后根據(jù)Sommer氏表,確定粗提物的毒性,以小鼠單位MU表示,1MU定義為15分鐘使20g小白鼠中毒致死所需的毒素量。空白實驗:取2只小白鼠,在其腹腔處注入1ml鹽酸溶液(pH3.55),1小時內(nèi)無死亡。毒性實驗:根據(jù)以往預(yù)試驗,取0.3mlSTX提取液,用HCl(pH3.55)稀釋至6ml(pH4.72)。取5只小白鼠,于每只腹腔注射1mlSTX稀釋液,觀察記錄每只小白鼠的死亡時間,死亡判定以最后一次喘息為準。1.2.4小鼠血清學(xué)指標檢測取18~22g小白鼠64只,分成9個組。其中,4個組的小白鼠分別腹腔注射1mlpH5.3的生理鹽水(對照組);4個組的小鼠分別腹腔注射1ml0.5MU/ml生理鹽水STX毒素(pH5.3),作為染毒組;1個組做空白組(不注射)。在30min,6h,12h,24h后,分別對一組染毒小鼠和一組對照組小鼠進行摘眼球采血,空白組在同樣條件下用相同方法進行采血。用AC970型全自動血球計數(shù)儀對所采血樣進行分析。2結(jié)果2.1小鼠毒力大小及死亡癥狀所對應(yīng)的sommer表t采取AOAC小鼠生物檢測法,腹腔注射1ml適當稀釋的藻毒素提取液,使小鼠死亡時間落在4~8min內(nèi),觀察其死亡癥狀,根據(jù)sommer表換算毒力大小。查sommer表可知,小白鼠平均死亡時間為306秒所對應(yīng)的鼠單位是約1.89MU;而平均體重為19.92克時對應(yīng)的鼠單位校正系數(shù)約為1.000。所以,1mL該STX提取液的毒素含量為:鼠單位×稀釋倍數(shù)=1.89Mu×(6ml/0.3ml)=37.8MU。2.2紅細胞計數(shù)采用單因素F測定,所得數(shù)據(jù)見表2和表3。其中的縮寫,RBC:紅細胞計數(shù),HGB:血紅蛋白計數(shù),HCT:紅細胞壓積,MCV:紅細胞平均容積,MCH:紅細胞平均血紅蛋白,MCHC:紅細胞平均血紅蛋白濃度,PLT:血小板計數(shù),WBC:白細胞計數(shù),LYM:淋巴細胞,MID:中性分葉細胞,GRA:顆粒細胞。2.3差無明顯差異時的單尾概率分別對0.5,6,12,和24h后的酸性對照組和染毒組的對應(yīng)生理指標進行兩組數(shù)據(jù)的單因素F測定,所得方差無明顯差異時的單尾概率列于表2中。將在腹腔注射0.5MU/mlSTX(pH5.3)或0.9%NaCl(pH5.3)后沒有顯著影響的紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)和有顯著或極其顯著變化的紅細胞壓積(HCT)、白細胞(WBC)、中性分葉細胞(MID)和顆粒細胞(GRA)按0.5、6、12、24h的順序制成表3。3stx分次注射毒性試驗從表2中,我們可看出:0.5h后,酸性生理鹽水對照組小白鼠的白細胞數(shù)量與染毒組小白鼠的白細胞數(shù)量間有顯著差異;其中,中性分葉細胞的數(shù)量則有極其顯著差異,其余各指標均無顯著差異。6小時后,所有指標無顯著差異。12h后,酸性生理鹽水對照組小白鼠的紅細胞壓積與染毒組小白鼠的紅細胞壓積之間有顯著差異。24h后,兩組小白鼠間的各指標中只有GRA有極其顯著差異。從數(shù)據(jù)中,我們至少可以得出兩點:第一,0.5MU/mlSTX在腹腔注射小白鼠后的0.5、6、12、24h這幾個時間段除了對紅細胞壓積(HCT,見表3)有顯著影響外,對小白鼠的紅細胞,血紅蛋白,血小板等沒有顯著影響,然而,卻引起白細胞的數(shù)量發(fā)生顯著或極其顯著的變化;第二,在毒素注射后的不同時間,白細胞數(shù)量的變化程度和變化趨勢是不一樣的,且?guī)追N占優(yōu)勢地位的白細胞(如,LYM,MID,GRA等)占總白細胞數(shù)量的百分比在發(fā)生改變。這些變化從表3中可看出。從表3的RBC和HGB看來,雖然不同時間段的數(shù)據(jù)有較大差異(染毒組RBC:9.196×1012/L,7.925×1012/L,8.523×1012/L,8.038×1012/L,8.43×1012/L;染毒組HGB:148.2g/L,131.4g/L,139.7g/L,135g/L,139.3g/L),但酸性生理鹽水對照組和染毒組之間卻幾乎一樣。換句話來說,至少對于0.5MU/mlSTX,在本實驗所測的幾個時間段,導(dǎo)致這些數(shù)據(jù)不同時期的變化的原因是酸中毒(0.9%NaCl,pH5.3),而不是STX(0.5MU/ml,pH5.3)中毒。在表3的WBC、MID和GRA中,有兩個共同的特別顯著的地方:其一,在0.5h時間段,染毒組與酸性生理鹽水對照組之間的差距特別明顯,后者大多是前者的一倍以上(WBC數(shù)量,STX組:1.93×109/L,HCl組:4.23×109/L;MID數(shù)量,STX組:0.29×109/L,HCl組:1.02×109/L;GRA數(shù)量,STX組:0.11×109/L,HCl組:0.689×109/L),而其它時間段則不明顯;其二,每一個染毒組的數(shù)據(jù)幾乎都是在0.5h時間段降到最低點,其后慢慢回升,而酸性生理鹽水對照組的數(shù)據(jù)都是在12h時間段才降到最低(WBC降到2.90×109/L;MID降到0.31×109/L;GRA降到0.06×109/L),然后再恢復(fù)到正常水平。對以上結(jié)果分析,pH5.3,0.5MU/ml的STX進入小白鼠血液后,酸和STX毒素分別通過神經(jīng)體液等調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響各血細胞生理指標,在0.5h內(nèi),主要是STX毒素發(fā)揮毒理效應(yīng),隨著STX毒素分布到各組織器官及通過排泄系統(tǒng)排出體外,其毒性效應(yīng)也逐漸減弱;而酸則在12h時發(fā)揮最大毒力效應(yīng),隨后也逐漸減弱。從表3中,我們還可看到,在12h以前,每個時間段的中毒組數(shù)據(jù)都要比酸性生理鹽水對照組數(shù)據(jù)小,而24h的數(shù)據(jù)則稍大。其原因可能是,12h之前STX毒素的毒力作用占主導(dǎo),而24h則是酸中毒占主導(dǎo)。當然,這個結(jié)果是基于0.5MU/mlSTX毒性和pH5.3酸度的基礎(chǔ)之上的,不同的STX毒量和酸度會使這種關(guān)系發(fā)生移動,這有待于進一步的研究。經(jīng)過精確的定量研究,確定STX毒量和酸度與染毒深淺之間的數(shù)量關(guān)系,再輔于血氣指標與染毒深淺之間的數(shù)量關(guān)系,或許可作為一種簡易、快速的STX中毒臨床試驗方法。據(jù)目前所知,動物STX中毒死亡的