膜片鉗技術(shù)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用

膜片鉗技術(shù)在藥學(xué)研究中的應(yīng)用前言德國物理學(xué)家Neher和Sakmann[1.2]建立的膜片鉗技術(shù)（patchclamptechnique）是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞上單一的（或多數(shù)的）離子通道活動的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用。作為先進(jìn)的細(xì)胞電生理技術(shù)，它一直被奉為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以證實(shí)細(xì)胞膜上離子通道的存在，并能對其電生理特性、分子結(jié)構(gòu)、藥物作用機(jī)制等進(jìn)行深入的研究?；蚪M學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，以離子通道為靶標(biāo)的藥物研究在未來具有很大的發(fā)展空間。關(guān)鍵詞膜片鉗技術(shù)；藥學(xué)研究；應(yīng)用Abstract[]Thepatch-clamptechnique,adominanttechniqueincellularelectrophysiology,isalwaysbeingregardedasthegoldstandardforionchannelresearch..Applicationofthepatch-clamptechniquecandemonstratetheexistencesofionchannelsandprovidevaluableinformationforionchannels,includingtheirelectrophysiologicalproperties,molecularstructuresandthemechanismofdrugaction.Genomicsandproteomicsresearchhasshowedthatthedevelopmentofdrugsforionchanneltargetwouldbeverypromisinginfuture.Keywords Patch-clamptechnique;StudyonMedicinalchemistry;Application80年代初發(fā)展起來的膜片鉗技術(shù)（patchclamptechnique）為了解生物膜離子單通道的門控動力學(xué)特征及通透性、選擇性膜信息提供了最直接的手段，該技術(shù)的興起與應(yīng)用，使人們不僅對生物體的電現(xiàn)象和其它生物現(xiàn)象有更進(jìn)一步的了解，而且基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，以離子通道為靶標(biāo)的藥物研究在未來具有很大的發(fā)展空間。為了突破由于篩選技術(shù)所造成的對離子通道為靶標(biāo)的藥物開發(fā)的瓶頸，近年來，對膜片鉗技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)以適合藥物高通量篩選的要求，由此產(chǎn)生了一些技術(shù)。膜片鉗技術(shù)原理及特點(diǎn)膜片鉗技術(shù)通過玻璃微電極與細(xì)胞膜形成高阻封接，可以測到1pA的電流靈敏度，1㎜空間分辨力及10ms時間分辨力，為從分子水平了解生物膜離子通道的開啟和關(guān)閉、動力學(xué)、選擇性和通透性等膜信息，提供了直接手段。膜片鉗技術(shù)對膜電壓的鉗制是通過負(fù)反饋回路而實(shí)現(xiàn)的。這種負(fù)反饋電路要求細(xì)胞膜電位在所有時間都與經(jīng)放大器輸出的指令電壓相等。當(dāng)由于離子通道的開放造成膜電位與指令電位之間發(fā)生差異時，微電極放大器就通過記錄電極向胞內(nèi)自動注入大小相等和方向相反的電流而使膜電位得以鉗制。通過記錄放大器用以維持細(xì)胞膜鉗制電位所輸出的電流大小，即可推算出由于離子通道開放所產(chǎn)生的電流的大小，以及由此導(dǎo)致的膜電導(dǎo)的改變。膜片鉗技術(shù)有不同的記錄方法，如細(xì)胞貼附式、全細(xì)胞式、內(nèi)面向外式、外面向內(nèi)式等。根據(jù)研究目的和觀察內(nèi)容的不同，可采取相應(yīng)的記錄方法。此外，還有穿孔膜片鉗記錄、帶核膜片記錄、人工脂膜的膜電流記錄等其它記錄方式。表1膜片鉗記錄模式[5.6]記錄模式形成方式優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)常規(guī)全細(xì)胞記錄模式形成高阻封接后，向毛細(xì)管內(nèi)施加負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，即形成全細(xì)胞記錄模式串聯(lián)電阻小，細(xì)胞不容易受損而死，可對許多常規(guī)微電極不能研究的小細(xì)胞進(jìn)行研究，實(shí)驗中有好的信噪比；可以控制細(xì)胞外成分就某種離子進(jìn)行針對性研究，可在電流鉗下做動作電位。細(xì)胞內(nèi)可流動的小分子能滲漏到電極液中，被電流迅速失活細(xì)胞貼附式將微吸管吸附于膜表面，形成高阻封接即可直接施加負(fù)壓對膜片進(jìn)行電壓鉗制，可以在保持細(xì)胞內(nèi)正常環(huán)境時對離子通道的活性進(jìn)行觀察監(jiān)測不能人為控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，不能準(zhǔn)確測量胞內(nèi)電壓，外液中加入的刺激劑無法到達(dá)與電極內(nèi)液接觸的細(xì)胞外表面膜內(nèi)面向外式形成全細(xì)胞模式后，將微吸管提起使膜片與細(xì)胞體分離，尖端形成的小泡幾秒后破裂即形成此模式可直接且自由地經(jīng)外液介導(dǎo)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)液環(huán)境，并可在和細(xì)胞活動無關(guān)的條件下記錄到單一離子通道的活動因有細(xì)胞質(zhì)滲漏可能會出現(xiàn)下落跡象膜外面向外式形成全細(xì)胞模式后，將微吸管提起使膜片與細(xì)胞體分離，膜片自然封合，即可形成?？稍谧杂筛淖兗?xì)胞外液環(huán)境的情況下，記錄單一離子通道的電流活動有可能丟失細(xì)胞質(zhì)因子開放細(xì)胞吸附膜內(nèi)面向外式形成高阻封接后，對吸附膜片外的其它部分進(jìn)行機(jī)械破壞即可經(jīng)破壞孔調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)液成分，來記錄單通道電流信號，如果細(xì)胞體積越大，破壞孔離吸附膜片越遠(yuǎn)或破壞孔越小，則越可能使細(xì)胞質(zhì)因子外流變慢對細(xì)胞有機(jī)械損傷穿孔囊泡膜外面向外式形成穿孔膜片模式后，提起微吸管便在管尖端處形成一個膜囊泡如果形成的模式好，此膜囊泡內(nèi)不僅有細(xì)胞質(zhì)因子還可能有線粒體等細(xì)胞器存在，可以在比較接近正常細(xì)胞內(nèi)信號傳遞條件和代謝條件的基礎(chǔ)上，記錄到單一離子通道電流只能進(jìn)行一價離子電流的測定膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用膜片鉗技術(shù)自從發(fā)明以來，被廣泛用于生物學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)、藥學(xué)等多種學(xué)科的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中，并與其他許多技術(shù)進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合，為解決生物學(xué)跨膜信號傳導(dǎo)問題提供了革命性的手段。1.膜片鉗技術(shù)在通道研究中的重要作用應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時可發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型，并能在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上進(jìn)一步計算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開放概率，還可以用以研究某些胞內(nèi)或胞外物質(zhì)對離子通道開閉及通道電流的影響等。同時用于研究細(xì)胞信號的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分泌機(jī)制。結(jié)合分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)，膜片鉗技術(shù)可用于離子通道分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能關(guān)系的研究。另外，利用膜片鉗技術(shù)還可以用于藥物在其靶受體上作用位點(diǎn)的分析。如神經(jīng)元煙堿受體為配體門控性離子通道，膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)通過記錄煙堿誘發(fā)電流，可直觀地反映出神經(jīng)元煙堿受體活動的全過程，包括受體與其激動劑和拮抗劑的親和力，離子通道開放、關(guān)閉的動力學(xué)特征及受體的失敏等活動。使用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)觀察拮抗劑對煙堿受體激動劑量效曲線的影響，來確定其作用的動力學(xué)特征。然后根據(jù)分析拮抗劑對受體失敏的影響，拮抗劑的作用是否有電壓依賴性、使用依賴性等特點(diǎn)，可從功能上區(qū)分拮抗劑在煙堿受體上的不同作用位點(diǎn)，即判斷拮抗劑是作用在受體的激動劑識別位點(diǎn)，離子通道抑或是其它的變構(gòu)位點(diǎn)上。2.與藥物作用有關(guān)的心肌離子通道心肌細(xì)胞通過各種離子通道對膜電位和動作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能。近年來，國外學(xué)者在人類心肌細(xì)胞離子通道特性的研究中取得了許多進(jìn)展，使得心肌藥理學(xué)實(shí)驗由動物細(xì)胞模型向人心肌細(xì)胞成為可能。目前利用膜片鉗技術(shù)的實(shí)驗研究所涉及的主要離子通道有以下四種：2.1快鈉通道能夠去極化心肌細(xì)胞，傳播動作電位，對維持細(xì)胞興奮性及正常生理功能有重要作用。另外，鈉通道具有其選擇性拮抗劑河豚毒及局麻藥和Ⅰ性抗心律失常藥的結(jié)合位點(diǎn)。Feng等用全細(xì)胞記錄法證實(shí)急性分離和培養(yǎng)的人心房細(xì)胞鈉通道主要參數(shù)無明顯差別。而心外膜下與心內(nèi)膜下鈉通道的阻斷作用延長動作電位計不應(yīng)期而減輕或逆轉(zhuǎn)實(shí)行心律失常。2.2鈣通道心肌的興奮與收縮和心肌細(xì)胞鈣離子通道密切相關(guān)。目前膜片鉗技術(shù)已在心肌細(xì)胞上記錄到L、T和B型電壓依賴性鈣通道。L型鈣通道目前研究最多，心肌以持久開放、失活緩慢的L型占優(yōu)勢，具有電壓、時間依賴性。2.3鉀通道種類最多，作為一大類通過調(diào)節(jié)膜電位而降低組織興奮性，通過阻抗去極化影響動作電位的頻率及動作時程，因而能夠在不同的時程和電位水平精確調(diào)控細(xì)胞靜息膜電位和動作電位。目前已經(jīng)能夠根據(jù)不同的通道敏感阻斷藥物和各自不同的激活/失活電位進(jìn)行鑒別和區(qū)分。主要有：內(nèi)向整流鉀電流、延遲整流鉀電流、瞬間外向鉀電流。隨著膜片鉗技術(shù)的不斷完善，可能會新發(fā)現(xiàn)更多的離子通道類型，并闡述其結(jié)構(gòu)與功能。3.對離子通道生理與病理情況下作用機(jī)制的研究通過對各種生理或病理情況下細(xì)胞膜某種離子通道特性的研究，了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機(jī)制。如對鈣離子在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損害中作用機(jī)制的研究表明，缺血性腦損害過程中，Ca2+介導(dǎo)現(xiàn)象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道開放，過多的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)Ca2+超載，導(dǎo)致神經(jīng)元及細(xì)胞膜損害，膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，嚴(yán)重的可使神經(jīng)元壞死[10]。4.對單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究將膜片鉗技術(shù)與單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)欠磻?yīng)技術(shù)結(jié)合，在全細(xì)胞膜片鉗記錄下，將單細(xì)胞內(nèi)容物或整個細(xì)胞（包括細(xì)胞膜）吸入電極中，將細(xì)胞內(nèi)存在的各種mRNA全部快速逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增及待檢的特異mRNA的檢測，借此可對形態(tài)相似而電活動不同的結(jié)果做出分子水平的解釋或為單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提供標(biāo)本，為同一結(jié)構(gòu)中形態(tài)非常相似但功能不同的事實(shí)提供分子水平的解釋。目前國際上掌握此技術(shù)的實(shí)驗室較少，我國北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所于1994年在國內(nèi)率先開展。5.對藥物作用機(jī)制的研究在通道電流記錄中，可分別于不同時間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，研究它們對通道功能的可能影響，了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動物生理功能的分子機(jī)理。這是目前膜片鉗技術(shù)應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，既有對西藥藥物機(jī)制的探討，也廣泛用在重要藥理的研究上。如開麗等報道細(xì)胞貼附式膜片鉗單通道記錄法觀測到人參二醇組皂苷可抑制正常和“缺血”誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元L-型鈣通道的開放，從而減少鈣內(nèi)流，對缺血細(xì)胞可能有保護(hù)作用。陳龍等報道采用細(xì)胞貼附式單通道記錄法發(fā)現(xiàn)烏頭堿對培養(yǎng)的Wistar大鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣通道有阻滯作用。6.在心血管藥理研究中的應(yīng)用隨著膜片鉗技術(shù)在心血管方面的廣泛應(yīng)用，對血管疾病和藥物作用的認(rèn)識不僅得到了不斷更新，而且在其病因?qū)W與藥理學(xué)方面還形成了許多新的觀點(diǎn)。正如諾貝爾基金會在頒獎時所說：“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機(jī)理，為研制新的更為特效的藥物開辟了道路”。膜片鉗技術(shù)的一大優(yōu)點(diǎn)就是在通道電流記錄中，可分別于不同時間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物或毒素，研究他們對通道功能的可能影響。通過研究，一方面可深入了解哪些選擇性作用于通道的藥物或毒素影響動物和人生理功能的分子機(jī)理；另一方面，分析各種藥物對通道蛋白的選擇性相互作用的特點(diǎn)，提供有關(guān)通道蛋白亞單位結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的信息。近十年來心血管藥物學(xué)研究最重要的成就就是首先合成了各類鈣拮抗劑（如硝苯地平、硫氮卓酮和維拉帕米及其衍生物），隨著其在臨床上不斷應(yīng)用，人們逐漸發(fā)現(xiàn)鈣拮抗劑盡管有一定療效，但其負(fù)性肌力作用及反射性交感興奮作用是其缺陷。因此目前人們普遍認(rèn)為進(jìn)一步開發(fā)作用于鉀離子通道的藥物更為理想。7.創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選7.1創(chuàng)新藥物研究的發(fā)展現(xiàn)狀創(chuàng)新藥物研究可分為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)兩個階段。發(fā)現(xiàn)階段的研究，包括闡明疾病防治的分子和細(xì)胞機(jī)制及藥物作用的靶標(biāo)，發(fā)展尋找新藥的新理論、新方法、新技術(shù)，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)新藥物的先導(dǎo)化合物的分子結(jié)構(gòu)并及加以優(yōu)化。這是產(chǎn)生“重磅炸彈”式創(chuàng)新藥物的先決條件。這方面的研究進(jìn)展和新發(fā)現(xiàn)，將開辟新的研究方向，并可能直接成為一系列創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)的源泉和契機(jī)。藥物大多通過于人體內(nèi)“靶標(biāo)”分子的相互作用而產(chǎn)生療效。以藥物靶標(biāo)為基礎(chǔ)的創(chuàng)新藥物體系是快速發(fā)現(xiàn)藥物的重要手段。據(jù)統(tǒng)計，目前治療藥物的作用靶點(diǎn)共483個。隨著人類基因組、蛋白質(zhì)組和生物芯片等研究的進(jìn)展，大量的疾病相關(guān)基因?qū)⒈话l(fā)現(xiàn)，人們預(yù)測到2010年藥物作用靶標(biāo)分子可能急劇增加到5000種。在已發(fā)現(xiàn)的藥物靶標(biāo)中離子通道類藥物靶點(diǎn)僅占5%，而基因組學(xué)、蛋白組學(xué)研究顯示離子通道具有多樣性和復(fù)雜性，在大約5000個潛在藥物作用靶標(biāo)中，離子通道類藥物靶點(diǎn)將上升到15%，以離子通道為靶標(biāo)的藥物研發(fā)大有可為。從而，突破離子通道藥物篩選這一藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的瓶頸就成為必須跨越的一步，迫切需要針對這個靶標(biāo)建立全新的高通量篩選方法。目前在離子通道高通量篩選中主要是進(jìn)行樣品量大、篩選速度占優(yōu)勢、信息量要求不太高的初級篩選。最近幾年，分別形成了以膜片鉗和熒光探針為基礎(chǔ)的兩大主流技術(shù)市場。將電生理研究信息量大、靈敏度高等特點(diǎn)與自動化、微量化技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了自動化膜片鉗等一些新技術(shù)。7.2膜片鉗技術(shù)的新進(jìn)展8.膜片鉗技術(shù)應(yīng)用于重要領(lǐng)域的展望盡管膜片鉗技術(shù)自它發(fā)明以來在醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域中發(fā)揮出巨大的作用，但在中醫(yī)藥領(lǐng)域還沒有得到充分應(yīng)用。由于中醫(yī)藥理論是一種建立在直觀觀察水平上的醫(yī)學(xué)經(jīng)驗家哲學(xué)思辨式的自然哲學(xué)形態(tài)的理論假說，它的缺陷在于它對構(gòu)成整體生命活動、病理變化的微觀層次的結(jié)構(gòu)與功能缺乏應(yīng)有的探索和真正的揭示。中醫(yī)藥學(xué)的臟象、脈象、舌象、用藥法則都是由其內(nèi)在的物質(zhì)結(jié)構(gòu)與其功能相互影響而產(chǎn)生的，一味地把中醫(yī)臟象只視為“機(jī)能單位”，在研究中重功能，輕形態(tài)，顯然是片面的、有害的；另一方面人是由多層次組成的復(fù)雜系統(tǒng)，整體層次上的生命活動是由其下個層次的相互作用而實(shí)現(xiàn)的，離開對整體水平已下各層次的結(jié)構(gòu)與功能的認(rèn)識，緊緊把握整體的生命活動與病變及其防治規(guī)律，遠(yuǎn)未真正揭示生命和疾病的本質(zhì)和規(guī)律，既然中醫(yī)藥學(xué)的研究對象是人，它就應(yīng)歸屬于生命科學(xué)，應(yīng)探索、揭示構(gòu)成人體各層次上的生命活動與病理變化。因此，中醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展方向應(yīng)是：擺脫自然哲學(xué)形態(tài)，向科學(xué)理論轉(zhuǎn)化，由整體層次的直觀描述向更深、更微觀層次的本質(zhì)闡明邁進(jìn)[11]。提高中藥藥理研究水平，應(yīng)當(dāng)采用新的靶標(biāo)，從細(xì)胞-亞細(xì)胞-受體、酶-基因水平，深入深入研究。應(yīng)用膜片鉗技術(shù)來研究中藥藥理是中藥藥理研究的新靶標(biāo)，是向細(xì)胞-亞細(xì)胞-受體、酶-基因水平