基于間接競爭酶聯(lián)免疫法的軟海綿酸檢測方法的建立

基于間接競爭酶聯(lián)免疫法的軟海綿酸檢測方法的建立

大田軟海綿酸（oa）是腹瀉性貝類毒素（sd）的主要成分。這種海藻來源廣泛。它是中國最常見的中毒事件之一，也是最大的破壞因素之一。然而，中國尚未應用于可接近的軟海綿酸檢測方法。因此，有必要對中國自己的軟海綿酸檢測方法進行改進。與其他檢測方法相比,酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性好、重復性高和檢測準確快速的優(yōu)點,在現(xiàn)場快速檢測上具有開發(fā)前景,近年來在赤潮藻毒素快速檢測方面得到重視和發(fā)展。本實驗室在成功制備高效價OA單克隆抗體的基礎上,初步建立了檢測OA的間接競爭酶免疫學檢測方法,為研制具有自主知識產(chǎn)權的相關檢測試劑盒奠定了基礎。1材料和方法1.1材料和試劑雜交瘤細胞株由本課題組研制和凍存;BALB/c健康小鼠由中國科學院實驗動物中心研究所提供。其他試劑國產(chǎn)分析純。1.2單克隆抗體制備按常規(guī)小鼠腹水法制備單克隆抗體。1.3抗原劑2.5mg/l的制備按文獻的方法制備。1.4間接競爭檢測方法的建立1.4.1抗羊血清學抗體檢測在96孔ELISA板上按常規(guī)方法進行。檢測抗原用包被緩沖液pH9.6,0.05mol/L碳酸鹽緩沖液稀釋為1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000四個濃度,每濃度做3個重復;OA抗體用含5%牛血清的稀釋液稀釋成1∶5000、1∶10000∶1∶15000、1∶20000、1∶40000、1∶6000、1∶8000七個濃度梯度;封閉液為1%明膠;酶標二抗羊抗鼠IgG濃度為1∶5000;顯色液為TMB;終止液為2mol/LH2SO4。在酶標儀上測定OD450值。1.4.2抗反應時間根據(jù)以上試驗選取最佳的抗原、抗體稀釋度包板,將一抗的保溫時間設為30、60、90、120min4組,每組3個平行,二抗反應時間固定為60min。測定OD450值,選擇最佳一抗反應時間。固定此最佳的一抗反應時間,將二抗反應時間設為30、60、90、120min4組,每組3個平行,重復以上試驗,根據(jù)OD450值選擇最佳二抗反應時間。1.4.3甲醇對免疫反應的影響一抗和甲醇同時加入,每孔甲醇終濃度設置為0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%等11個濃度梯度,測OD450值。根據(jù)OD450值的大小進行判定甲醇對免疫反應的影響。甲醇溶解OA后和一抗同時加入,OA濃度為1∶8000;每孔甲醇的終濃度為20%、30%、40%。另設一組不加OA的作為陰性對照組。測OD450值,計算出抑制率。1.5標準工作曲線的繪制OA終濃度稀釋為200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.3125ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL13個濃度梯度,按最佳的稀釋度和反應時間,用間接競爭ELISA法檢測OD450值,以抑制率(P/N)為縱坐標,以log(10×OA濃度)為橫坐標繪制標準工作曲線。1.6elisa法提取殘余物方法參見(Tagmouti-TalhaF,2000)。將貝類樣品洗凈、勻漿,稱取5g于離心管,加入弱酸性的甲醇溶液,隨后加入一定量的OA標準液。3500r/min離心10min,取上清。將上清分裝兩管,分別加入甲醇和正己烷,渦旋混勻,靜止分層。棄正己烷層,在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干,加少量甲醇溶解壁上附著物,再蒸干。最后用100μL甲醇溶解殘余物,再加900μLPBST,混勻。提取物進行ELISA檢測。OA的實測含量(ng/mL)是根據(jù)酶標板上測得OD450值后由標準曲線求得log(10×OA濃度),再通過反對數(shù)計算得出。1.7準確度測量取一定量樣品,平行提取,同時檢測,求得實測濃度。1.8加標回收率a抑制率P/N(%)=(A0-A)/A0×100%(A為吸光值);回收率=實測濃度/添加濃度×100%;精密度=變異系數(shù)=SD/X(X為實測濃度的平均值,SD為標準差)。2結(jié)果2.1抗體最適工作濃度按試驗方法測定OD450值,選OD450值為2.0左右的確定為抗原抗體最適工作濃度。結(jié)果顯示,檢測抗原OA-OVA按1:2000稀釋即濃度為1.25μg/L,單抗稀釋度為1:20000時,既能保證免疫反應效果好,又使得抗原抗體用量最少。2.2甲醇對aa免疫反應的影響試驗結(jié)果表明,未加OA時,OD450隨著一抗中甲醇濃度的提高而遞增,當甲醇終濃度高于10%時,這種遞增趨勢更明顯。當OA與甲醇同時加入時,甲醇濃度的增加會降低OA免疫反應的抑制率(如圖1)。因此,樣品提取時,為了保證OA全部萃取出來,可先用少量甲醇將其溶解,再用緩沖溶液PBST將甲醇含量稀釋到10%以下,而在ELISA檢測時,可以直接用PBST稀釋OA標準溶液或樣品溶液,將甲醇對檢測的干擾減少到最低值。2.3抗a間接競爭免疫抑制反應的穩(wěn)定性從試驗結(jié)果得知,未加OA時,吸光值OD450會隨著抗體反應時間的延長而增加,考慮到要節(jié)省檢測時間,因而選用抗體反應時間都為60min和90min進行OA間接競爭免疫抑制反應,結(jié)果如圖2所示,表明一抗和酶標二抗的反應時間均為60min時,其抑制率較高,即抗體對包被抗原結(jié)合反應的抑制效果最好。2.4酶標二抗溶液的配制用碳酸鹽緩沖液將OA-OVA包被原稀釋為1∶2000,包被96孔酶標板,每孔100μL,4℃過夜;棄殘液,洗板;用1%明膠封板,每孔150μL,37℃下保溫2h;棄封閉液,洗板,用PBST將OA標準溶液或貝類萃取液稀釋為系列濃度,分別與等體積的單抗混勻,單抗終稀釋度為1∶20000,每孔加入100μL,37℃下保溫1h;棄去殘液,洗板,加入酶標二抗,按產(chǎn)品說明書推薦的濃度1∶5000進行稀釋,每孔100μL,37℃下保溫1h;洗板3次,每孔加入100μL顯色液,室溫下反應10～15min,加入終止液,測OD450值。2.5elisa標準工作曲線試驗結(jié)果如圖抑制率曲線(圖3)和標準曲線(圖4)。抑制率曲線呈“S”分布。當OA的濃度低于0.3125ng/mL時,抑制率幾乎降到0,而高于50ng/mL時,OA對免疫反應的抑制效果幾乎一樣,因此,OA濃度的有效檢測范圍在0.3125ng/mL～50ng/mL之間,在此范圍內(nèi)繪制OA間接競爭ELISA標準曲線。標準曲線的回歸方程和相關系數(shù)分別為y=0.392x-0.054,R2=0.955,有效線性檢測范圍為0.3125ng/mL～50ng/mL,IC50為2.59ng/mL,檢測限為0.45ng/mL。2.6回收率與精密度在OA陰性的貝類樣品中分別加入12.5、25、125、500ng/mL的OA標準溶液,提取后用本試驗建立的間接競爭ELISA法進行檢測,其回收率與精密度結(jié)果見表1。此方法平均回收率為55.85%,變異系數(shù)為3.03%～8.94%,說明該方法重復性良好,無需在樣品檢測時做更多平行樣。既節(jié)約了試劑成本,又節(jié)約了人力和時間的消耗。3elisa法檢測aa中的靈敏度、限和檢測限目前,國內(nèi)檢測OA的方法主要是小鼠法、高效液相色譜法(HPLC)和免疫檢測技術(ELISA)。小鼠法簡便易行,但缺點是受干擾較大,數(shù)據(jù)不精確;HPLC法可準確分析毒素的含量和種類,檢測限可低至ng/g,但樣品前處理過程復雜,儀器昂貴,需要專門人員;ELISA法比HPLC法樣品前處理簡單得多,特異性好,無需純化濃縮。另外,ELISA法比HPLC法操作時間短,一次可處理大量樣品,而且,ELISA法比HPLC法投資小,適合基層單位使用,因此呈現(xiàn)出了較好的應用前景,受到國內(nèi)外研究人員的廣泛關注。國外多家公司已開發(fā)研制出了檢測OA的試劑盒,如日本PanapharmLaboratories公司生產(chǎn)的OAELISA檢測試劑盒檢出限是10ng/mL,美國柏爾BIOO公司也生產(chǎn)出了OAELISA檢測試劑盒,但由于價格昂貴,遠不適用于我國商檢部門的大量應用。近幾年國內(nèi)外均開展了許多關于OA毒素的檢測研究,如盧士英,用ELISA法檢測OA的線性范圍為0.4ng/mL～25ng/mL,而本研究的線性檢測范圍為0.3125ng/mL～50ng/mL,比其檢測范圍要廣;李愛峰利用蛋白磷酸酶活力抑制法檢測OA的最低濃度為0.6ng/mL,TakashiU等建立的ELISA檢測腹瀉性貝毒方法檢出限為10ng/mL,而本研