動脈夾法制備脊髓缺血再灌注損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究

動脈夾法制備脊髓缺血再灌注損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究

脊柱側(cè)支異常（西醫(yī)，r）的病理機(jī)制的研究已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和計算機(jī)科學(xué)領(lǐng)域的難題和熱點(diǎn)。它是脊柱手術(shù)中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。脊髓缺血再灌注時一些氧自由基、興奮性氨基酸等細(xì)胞外的刺激因素,通過絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi),引起細(xì)胞的修復(fù)或凋亡。由于脊髓是許多神經(jīng)功能的中介通路,脊髓缺血再灌注損傷及其繼發(fā)性病理生理反應(yīng)可直接導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷,從而引起組織、器官功能障礙;由于治療困難,致殘率與致死率非常高。目前對脊髓損傷的研究相對緩慢,預(yù)后難以預(yù)料,主要是脊髓缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜,人們對此認(rèn)識還不夠全面、深入,而建立一個合理的脊髓缺血再灌注損傷模型是進(jìn)行脊髓缺血再灌注損傷基礎(chǔ)研究的前提。大鼠脊髓缺血再灌注損傷模型的建立通常使用動脈夾對腹主動脈進(jìn)行結(jié)扎,以達(dá)到缺血的目的。一般會在夾閉后關(guān)腹,防止由于麻藥失效且缺血未完成時,蘇醒的大鼠帶夾活動造成其他損傷,如臟器脫出,或由于傷口長時間暴露使臟器發(fā)生不必要的損傷。通常打開動脈夾再灌注需要通過二次開腹手術(shù)取夾。在二次手術(shù)時,如果麻藥失效追加麻藥會對實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的觀察測定起到負(fù)面影響;并且多次重復(fù)開關(guān)腹對模型大鼠無形中添加了更多的外部干擾因素,再次影響了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。還有一些試驗(yàn)在開腹結(jié)扎后一直等到缺血結(jié)束后再進(jìn)行關(guān)腹,長時間暴露在空氣中使臟器的自然狀態(tài)受到了破壞,模型動物體質(zhì)下降,恢復(fù)減慢,同樣干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的檢測。所以本實(shí)驗(yàn)使用絲線結(jié)扎對傳統(tǒng)的動脈夾結(jié)扎法進(jìn)行改進(jìn),通過神經(jīng)功能評分和脊髓與血管的病理組織學(xué)觀察來對兩種模型的效果進(jìn)行對比觀察。1材料和方法1.1材料a10只200±20gWistar大鼠雌雄不限,隨機(jī)分成4組,即動脈夾組1(10只),改進(jìn)組1(10只),動脈夾組2(10只)和改進(jìn)組2(10只)。10%水合氯醛麻醉,使大鼠仰臥固定,從大鼠左側(cè)肋骨下緣肋中線向下開口約5cm,找到左腎,沿腎動脈找到腹主動脈,動脈夾組結(jié)扎用10g標(biāo)準(zhǔn)動脈夾進(jìn)行結(jié)扎,改進(jìn)組用絲線進(jìn)行結(jié)扎,結(jié)扎后關(guān)腹,關(guān)腹前予青霉素清洗腹腔,其中動脈夾組1及改進(jìn)組1取缺血時間點(diǎn)45min,動脈夾組2及改進(jìn)組2取缺血時間點(diǎn)1h進(jìn)行再灌注,對兩個動脈夾組進(jìn)行二次手術(shù)取夾,兩個改進(jìn)組直接抽拽留在腹外的線頭,完成再灌注。1.2神經(jīng)行為特征分別于再灌注后24h對四組脊髓缺血再灌注損傷模型進(jìn)行后肢神經(jīng)功能評分。按照Tarlov標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)功能評分并記錄,0級:完全癱瘓;1級:輕微的功能活動;2級:下肢運(yùn)動良好,但不能站立;3級:能站立,但不能正常行走;4級:可行走,但不靈活;5級:完全恢復(fù)。1.3固定組采用10%緩沖福爾馬林溶液固定再灌注24h后,切除L2-4雙側(cè)椎板,充分顯露L3-4節(jié)段硬膜囊,切斷周圍神經(jīng)根,將同一節(jié)段脊髓取出,置10%緩沖福爾馬林溶液中固定。打開腹腔找到腹主動脈,取結(jié)扎處動脈段于10%緩沖福爾馬林溶液固定。將所有固定組織HE染色,切片,制病理切片,光鏡下觀察,照相。1.4統(tǒng)計分析用SSPS統(tǒng)計軟件對神經(jīng)功能評分實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行秩和檢驗(yàn),以P<0.05為存在顯著性差異。2結(jié)果2.1經(jīng)功能評分情況于再灌注后24h后,大鼠出現(xiàn)不同程度的下肢癱瘓,后肢神經(jīng)功能評分?jǐn)?shù)據(jù)見表1。分別對動脈夾組1和改進(jìn)組1,動脈夾組2和改進(jìn)組2進(jìn)行兩兩對比,結(jié)果表明動脈夾組1和改進(jìn)組1之間,動脈夾組2和改進(jìn)組2之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。2.2病理人類學(xué)2.2.1-高髓髓炎損傷模型動脈夾組(見圖1)和改進(jìn)組(見圖2)脊髓缺血再灌注損傷模型光鏡下可見脊髓神經(jīng)細(xì)胞腫脹,有炎細(xì)胞侵潤,神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死,損傷程度基本相同。2.2.2動脈夾組和鏡結(jié)果肉眼觀察可見四組結(jié)扎處由于物理損傷造成彈性下降,均可見環(huán)狀隆起。光鏡結(jié)果:動脈夾組(見圖3):動脈內(nèi)膜有破損,細(xì)胞排列不整齊,有大量炎細(xì)胞侵潤,平滑肌層變薄,線粒體腫脹。改進(jìn)組(見圖4):動脈外膜稍有破損,內(nèi)膜未見異常,可見大量炎細(xì)胞侵潤,肌纖維水腫,線粒體腫脹。3實(shí)驗(yàn)設(shè)計與模型改造本實(shí)驗(yàn)由于使用的是10g標(biāo)準(zhǔn)的動脈夾,在用結(jié)扎線進(jìn)行操作前進(jìn)行拉力訓(xùn)練,形成固定反射,以使每次結(jié)扎拉力接近10g,排除了由于每次操作時結(jié)扎拉力不同對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的人為誤差,使實(shí)驗(yàn)操作更加嚴(yán)謹(jǐn)。在絲線的選擇方面,我們最初選擇了粗、中、細(xì)3種不同型號的絲線進(jìn)行研究,分別為10號、4號和0號(強(qiáng)生公司愛惜康外科縫線系列)。在預(yù)試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn),0號絲線(細(xì))于再灌注拆線時極易將動脈拉斷,或發(fā)生滲血,使實(shí)驗(yàn)大鼠在結(jié)扎時由于腹主動脈斷裂或失血過多而死亡。4號絲線(中)再灌注拆線時雖然沒有動脈斷裂或滲血情況發(fā)生,但是取再灌注0h模型結(jié)扎處血管,肉眼觀察可見明顯的血管外膜損傷;進(jìn)一步觀察再灌注24h后模型大鼠死亡率達(dá)50%,經(jīng)過解剖檢查發(fā)現(xiàn)大鼠有不同程度的滲血情況。10號絲線(粗)再灌注拆線時沒有血管斷裂的情況發(fā)生,再灌注24h后無模型死亡,飼養(yǎng)2w后模型康復(fù)率達(dá)90%以上,證明該組絲線可進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證試驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)采用的側(cè)切口可以在保證最少出血量的同時最快且準(zhǔn)確地確定左腎位置,從而找到腹主動脈。相對于腹部正中切口,可以使實(shí)驗(yàn)動物臟器最小程度地暴露在外界環(huán)境中,并降低出血可能,且有效的縮短了開腹手術(shù)的時間。由于正中切口方法確定左腎位置時需要移動大部分的腹腔臟器,臟器的位移干擾了正常的腹腔內(nèi)部環(huán)境,對大鼠造成不必要的損傷,不利于客觀評價實(shí)驗(yàn)結(jié)果。也不利于實(shí)驗(yàn)動物的術(shù)后恢復(fù),所以此類實(shí)驗(yàn)操作施行側(cè)切口要優(yōu)于正中切口方法。在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行脊髓缺血再灌注損傷手術(shù),絲線結(jié)扎方法可與傳統(tǒng)動脈夾法達(dá)到相同的癱瘓水平,并且免去了二次開腹手術(shù)造成的額外傷害。由于絲線的體積遠(yuǎn)小于動脈夾,以及絲線材質(zhì)相對于動脈夾的金屬質(zhì)地更加輕巧,絲線在更大程度降低了在大鼠體內(nèi)的異物影響,使大鼠腹腔內(nèi)