大鼠脊髓損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元的變化

大鼠脊髓損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元的變化

在過去的20年里，通過各種骨髓損傷（ic）模型的出現(xiàn)，對髓傷的研究也取得了很大進(jìn)展。神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)后運動功能的恢復(fù)最終要依賴于運動終板結(jié)構(gòu)的保存及其生理功能的恢復(fù),由于周圍神經(jīng)是由脊髓神經(jīng)元、神經(jīng)干、外周靶器官三者組成的統(tǒng)一整體,那么脊髓運動神經(jīng)元中必然存在具有維持外周靶肌肉形態(tài)、發(fā)揮運動終板功能的神經(jīng)調(diào)制質(zhì)。許多研究已經(jīng)證實,降鈣素基因相關(guān)肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholineesterase,AChE)在該周圍神經(jīng)環(huán)路中發(fā)揮著及其重要的作用。1材料和方法1.1小鼠來源及免疫雌性Wistar大鼠由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,體重225～250g,隨機分成假手術(shù)組(A組,n=8)、切割型脊髓損傷組(B組,n=26)和撞擊型脊髓損傷組(C組,n=26)。小鼠來源抗人CGRP多克隆抗體、碘化乙酰硫代膽堿:Sigma公司;生物素化抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素:中杉試劑公司。1.2方法1.2.1髓組織損傷模型大鼠用6%水合氯醛6ml/kg腹腔注射麻醉,俯臥位固定于鼠板上,顯微鏡下暴露T8、T9脊髓。①切割型脊髓損傷模型:將脊髓硬脊膜打開,使用顯微外科剪刀將一段長約3mm脊髓全部切除,然后用吸引器于軟膜下吸斷未橫斷的脊髓組織,確認(rèn)此段無組織殘留;術(shù)中采用壓迫和電凝進(jìn)行止血,9/0顯微縫合線縫合硬脊膜,分層縫合肌肉、皮膚,碘酒消毒切口。②撞擊型脊髓損傷模型:采用NYU(北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心實驗室進(jìn)行)脊髓打擊器,沖擊重物為圓柱形,橫斷面直徑2.5mm,質(zhì)量10g,從距離T9表面60mm高度自由下落造成重度撞擊傷模型。③假手術(shù)組模型:暴露T9段脊髓而不造成脊髓損傷。術(shù)后給予青霉素2×105U/次,2次/d,按摩膀胱2～3次/d,防止泌尿系統(tǒng)及其他并發(fā)癥的發(fā)生。1.2.2常規(guī)精-伊紅染色損傷組大鼠手術(shù)1周后,經(jīng)4%多聚甲醛溶液灌注固定,取脊髓損傷處組織作常規(guī)石蠟包埋,縱行連續(xù)切片,片厚8μm,進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。1.2.3恒冷箱-20骨髓0.4重組切片采用Karnovsky-Roots直接法染色。術(shù)后1周、2周、4周、10周,B、C組大鼠各取6只灌注固定,取L2～L4脊髓節(jié)段進(jìn)行恒冷箱(-20℃)脊髓橫行冰凍切片,片厚30μm。切片入AChE孵育液[含醋酸緩沖液(pH=6.3)6.5ml、碘化硫代乙酰膽堿5mg、0.1mol/L枸櫞酸鈉0.5ml、30mmol/L無水硫酸銅1.0ml、雙蒸水1.0ml、5mmol/L高鐵氰化鉀(GR及AR級)1.0ml],37℃孵育1.5～2h。蒸餾水洗3次,脫水,透明,樹膠封片。1.2.4免疫組化處理術(shù)后1周、2周、4周、10周,B、C組大鼠各取6只灌注固定,取L2～L4脊髓節(jié)段進(jìn)行脊髓橫行冰凍切片,片厚30μm。0.01mol/LPBS-0.3%Triton-X100浸洗切片3次,每次5min,蒸餾水浸洗3遍,共10min。3%H2O2室溫孵育15min。0.1mol/LPBS-0.3%Triton-X100浸洗切片3次,共10min。5%山羊血清室溫孵育30min,直接入兔來源的CGRP多克隆抗體(1∶2000),4℃過夜。0.1mol/LPBS浸洗3遍,共10min。加入生物素化的山羊抗兔IgG(1∶300),室溫孵育3h。0.1mol/LPBS浸洗3遍,共10min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素(1∶300),室溫孵育3h。DAB顯色,室溫20min。DW終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。脫水,透明,樹膠封片。1.2.5運動功能恢復(fù)情況采用聯(lián)合均分(averagecombinedscores,ACOS)神經(jīng)行為學(xué)評定觀察大鼠后肢運動功能的恢復(fù)情況。大鼠術(shù)前適應(yīng)行為學(xué)觀察場地,每周評分1次,評分時間為1min,固定于晚間7:00進(jìn)行。1.2.6角運動神經(jīng)元的形態(tài)人類學(xué)觀察和形態(tài)分析法應(yīng)用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)測量AChE和CGRP陽性染色部位的透光度值。1.3統(tǒng)計方法數(shù)值以(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。2結(jié)果2.1術(shù)后1周后術(shù)后運動情況各組大鼠ACOS評分術(shù)前無顯著性差異(P>0.05),總分均可達(dá)到310分左右。A組大鼠術(shù)后評分無明顯變化;B組大鼠術(shù)后1周內(nèi)后肢呈弛緩性癱瘓,爬行運動完全靠前肢帶動;2周后部分大鼠出現(xiàn)后肢單或雙關(guān)節(jié)的運動恢復(fù);C組大鼠后肢在術(shù)后1周已經(jīng)開始出現(xiàn)2個以上關(guān)節(jié)的大幅度運動。在隨后的觀察時間內(nèi),兩組大鼠均出現(xiàn)明顯的后肢運動功能恢復(fù),C組大鼠ACOS評分始終高于B組,10周內(nèi)每周評分結(jié)果兩兩比較均有非常顯著性差異(P<0.01)(圖1)。2.2髓組織損傷B組大鼠損傷處組織行HE染色,均證實為脊髓完全橫斷,切片上可見脊髓無明顯腫脹,切口較整齊,脊髓組織在損傷處直徑略微變細(xì)。在C組大鼠脊髓切片上,損傷處腹側(cè)可見軟脊膜完整,有約0.1～0.2mm厚正常白質(zhì)結(jié)構(gòu)殘留。2.3各組大鼠ache陽性染色部位的比較正常L2～L4脊髓的前角AChE陽性反應(yīng)明顯,著色較深,可清晰看到前角運動神經(jīng)元和部分神經(jīng)元的突起(封三彩圖2.1)。術(shù)后1周,B、C組大鼠前角運動神經(jīng)元AChE著色與正常組無明顯差異;術(shù)后4周,B組明顯變淺(封三彩圖2.2),C組稍有變淺(封三彩圖2.3);術(shù)后10周,B組大鼠前角運動神經(jīng)元AChE著色仍較淺,但C組大鼠與4周時相比有了明顯的恢復(fù)。應(yīng)用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)分析,B、C組術(shù)后1周其AChE陽性染色部位的透光度與正常組相比無顯著性差異(P>0.05);術(shù)后4周B、C組與正常組相比透光度明顯增加(P<0.01),B、C組間相比也有顯著性差異(P<0.05);術(shù)后10周C組大鼠雖然與B組相比有了明顯的恢復(fù),但與正常大鼠相比仍有非常顯著性差異(P<0.01)(圖2)。2.4免疫組化染色正常大鼠于L2～L4節(jié)段染色可見前角運動神經(jīng)元胞漿被清晰標(biāo)記,輪廓清晰,染色較深(封三彩圖2.4)。B、C組大鼠術(shù)后1周CGRP免疫組化染色與正常組相比均明顯變淺(封三彩圖2.5、圖2.6);術(shù)后4周時,B組CGRP陽性染色仍較淺,C組CGRP免疫組化染色與1周時相比明顯加深;術(shù)后10周時,B組大鼠陽性染色神經(jīng)元輪廓仍不清晰,且陽性標(biāo)記的運動神經(jīng)元變少,但C組陽性染色神經(jīng)元輪廓較清晰,與正常組相比無明顯差異。應(yīng)用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)分析,B、C組大鼠損傷1周后CGRP陽性染色部位的透光度值較正常組大鼠明顯增大(P<0.01),B、C兩組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05);術(shù)后4周及10周時,B組與正常時相比透光度明顯增加(P<0.01),而C組與正常組相比無統(tǒng)計學(xué)差異,B、C兩組間相比有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。3c組不同處理治療股骨損傷后的前角運動神經(jīng)元檢測大鼠胸髓完全橫斷未接受任何干預(yù)措施的情況下,仍存在后肢運動功能的自發(fā)性恢復(fù)。這種自發(fā)恢復(fù)的機制與損傷部位以下腰骶段脊髓內(nèi)的低級步行控制中樞——中樞模式發(fā)生器(centralpatterngenerator,CPG)有關(guān)。許多動物的脊髓都存在CPG,由脊髓中間神經(jīng)元組成,之間有神經(jīng)信號通訊,其所構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)可使脊髓在完全失去下行運動神經(jīng)支配和上行感覺傳入的情況下產(chǎn)生一些節(jié)律性運動。2005年,Guertin提出了對胸髓損傷大鼠后肢運動功能進(jìn)行半定量評價的ACOS評分,將大鼠后肢的運動分為交替和非交替兩種類型,關(guān)節(jié)的運動幅度分為3個等級,觀察大鼠在1min內(nèi)交替和非交替運動的次數(shù),然后將以上指標(biāo)整合起來進(jìn)而得到一個數(shù)值,從而對脊髓損傷后大鼠的運動行為進(jìn)行半定量分析。該方法與傳統(tǒng)的BBB評分相比,能從量上體現(xiàn)功能的細(xì)小恢復(fù)變化,且BBB定性評分法主要是為存在白質(zhì)纖維殘留的不完全脊髓損傷而設(shè)計,對于評價脊髓完全橫斷損傷后的自發(fā)恢復(fù)不夠敏感,而ACOS評分對所有類型脊髓損傷均適用。通過評分發(fā)現(xiàn),兩種脊髓損傷后,后肢運動功能均出現(xiàn)一定的自發(fā)性恢復(fù),損傷4周以內(nèi)恢復(fù)較快,以后逐漸趨于穩(wěn)定,C組大鼠由于殘留纖維及CPG的雙重作用,后肢功能的恢復(fù)要明顯優(yōu)于B組。脊髓損傷后運動功能出現(xiàn)不同程度的自發(fā)性恢復(fù),作為脊髓重要結(jié)構(gòu)之一的前角運動神經(jīng)元一定起著十分重要的作用。Nakamura研究表明,大鼠頸髓不完全性損傷后,前角運動神經(jīng)元內(nèi)AChE活性變化與運動功能恢復(fù)具有較強的相關(guān)性。AChE主要來源于運動神經(jīng)元胞體,通過軸突快速運輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)終末,各種形式的AChE都能在脊髓運動神經(jīng)元和骨骼肌細(xì)胞中找到;AChE活性的強弱可反映運動神經(jīng)元的功能狀態(tài)。脊髓損傷后由于繼發(fā)的缺血、缺氧,導(dǎo)致了前角運動神經(jīng)元內(nèi)AChE的活性減弱。朱悅等研究發(fā)現(xiàn),脊髓不完全性損傷后脊髓前角運動神經(jīng)元內(nèi)的AChE活性減弱,但隨著時間的延長而有所回升。Krikorian發(fā)現(xiàn),大鼠脊髓橫斷傷后運動神經(jīng)元胞體和纖維中AChE活性于術(shù)后14個月內(nèi)持續(xù)減少,認(rèn)為這種變化可能與脊髓損傷的程度較重有關(guān)。CGRP與脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復(fù)也有著密切的關(guān)系。它在神經(jīng)細(xì)胞胞體合成,在感覺和運動神經(jīng)纖維中經(jīng)逆行和順行軸漿運輸在神經(jīng)元和神經(jīng)末梢之間進(jìn)行傳遞。CGRP能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的突觸傳遞。Marlier等觀察到,大鼠脊髓橫斷后,前角運動神經(jīng)元中CGRP隨時間推移(2d～5個月)而減少,并且推測可能是由于脊髓橫斷后導(dǎo)致前角運動神經(jīng)元失去了上運動神經(jīng)元對其CGRP合成的促進(jìn)信號,從而使得CGRP含量減少。本實驗顯示,在術(shù)后1周,損傷平面以下運動神經(jīng)元CGRP免疫組化染色陽性部位的著色明顯變淺,這與前人報道基本相符。然而,我們還發(fā)現(xiàn),C組大鼠由于損傷的不完全性,術(shù)后4周CGRP在前角運動神經(jīng)元的含量有了明顯的提高,與正常時相比無顯著性差異;脊髓損傷后早期損傷平面以下運動神經(jīng)