溝紋巴非蛤精子發(fā)生與超微結(jié)構(gòu)的演變

溝紋巴非蛤精子發(fā)生與超微結(jié)構(gòu)的演變

近幾十年來，許多軟體動物物種，尤其是雙殼類，具有較高的經(jīng)濟價值，增加了養(yǎng)殖前景，引起了研究者的關(guān)注，尤其是關(guān)于水生生物的研究。精子發(fā)生是生殖生物學(xué)的重要問題之一,精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異不僅是分類的依據(jù),也是分析不同動物類群之間親緣關(guān)系的重要依據(jù)。有關(guān)雙殼類軟體動物精子超微結(jié)構(gòu)及精子發(fā)生國內(nèi)外已有大量報道,如大珠母貝(Pinctadamaxima)、青蛤(Cyclinasinensis)、縊蟶(Sinonovaculaconstricta)和中國淡水蟶(Novaculinachinensis)等。溝紋巴非蛤(PaphiaexarataPhilippi)廣泛分布于中國浙江南部及廣東近海,個體大,肉味鮮美,越來越受到群眾的喜愛。但迄今為止,國內(nèi)外尚未見到有關(guān)溝紋巴非蛤精子發(fā)生超微結(jié)構(gòu)研究的報道。作者研究了其精子發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)特點及演變規(guī)律,以期加深對溝紋巴非蛤發(fā)育生物學(xué)的認(rèn)識,并為溝紋巴非蛤的人工繁殖提供科學(xué)依據(jù)。1精巢組織的測定試驗材料于2003年10月購自福州市程埔市場,殼長約為40mm。將性腺成熟的活體溝紋巴非蛤迅速解剖,取出大小約為2mm3的精巢組織,用3%戊二醛-1.5%多聚甲醛液于4℃固定2d,充分漂洗后,再用1%鋨酸-1.5%亞鐵氰化鉀液固定1.5h。漂洗;鈾塊染,乙醇-丙酮梯度脫水,環(huán)氧樹脂618包埋。LKB-V型超薄切片機切片,切片用醋酸鈾檸檬酸鉛雙重染色,日立Hu-12A透射電鏡觀察與攝影。2基膜及支持細(xì)胞的構(gòu)成溝紋巴非蛤的精巢由許多濾泡型腺體組成,濾泡的腔壁由基膜及位于其內(nèi)的生殖上皮和支持細(xì)胞構(gòu)成。生殖上皮向腔中央排列成一群不同發(fā)育階段的生殖細(xì)胞:精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精細(xì)胞和精子(圖1-1)。2.1電子密度和形態(tài)這類細(xì)胞數(shù)目較少,著生于精巢濾泡的基底膜上。精原細(xì)胞是生精細(xì)胞中最大的,形狀不規(guī)則,切面大小約為9.8μm×6.4μm。細(xì)胞核大,形狀與胞體一致,大小約為5.6μm×4.8μm,可見一電子密度高、直徑約1.4μm的核仁。核膜清晰,核周腔明顯。異染色質(zhì)呈現(xiàn)小塊狀分布在細(xì)胞核中。細(xì)胞質(zhì)較少,電子密度較低,含有豐富的橢圓形線粒體,散布于細(xì)胞兩側(cè),基質(zhì)電子密度低,看起來似空泡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較小,呈囊泡狀,還存在少量顆粒狀游離的核糖體,但未見高爾基體等細(xì)胞器(圖1-2)。2.2保幼細(xì)胞和精母細(xì)胞初級精母細(xì)胞由精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來,已完全脫離基膜。細(xì)胞近橢圓形,大小約為7.9μm×4.5μm。細(xì)胞核卵圓形,長約5.8μm,短約3.8μm。早期的初級精母細(xì)胞仍有1～2個核仁(圖1-3)。核內(nèi)異染色質(zhì)塊增大,稀疏分布。胞質(zhì)電子密度增高。橢圓形線粒體分布在細(xì)胞一側(cè),基質(zhì)的電子密度增高,嵴增多增長。可見小囊泡狀的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1-4)。2.3高爾基體的結(jié)構(gòu)初級精母細(xì)胞經(jīng)第一次成熟分裂產(chǎn)生次級精母細(xì)胞。這時期常見核分裂為二,而胞質(zhì)未分開的現(xiàn)象,形成雙核細(xì)胞(圖1-5),細(xì)胞橢圓形,長徑約5.0μm,短徑約4.1μm。細(xì)胞核橢圓形,大小約為4.5μm×2.5μm。細(xì)顆粒狀異染色質(zhì)凝聚成更大的團塊,且有些團塊互相融合在一起。線粒體數(shù)量略為減少,但體積增大,多集中在細(xì)胞的一側(cè),嵴的數(shù)量更多更長。中心體已出現(xiàn),并發(fā)出胞內(nèi)鞭毛(圖1-6)。高爾基體發(fā)育較好,它由一系列致密平行的扁平囊組成,呈新月狀,兩端膨大成泡狀,其周圍及附近分泌有嗜鋨的高爾基液泡。這些致密電子顆粒稱為前頂體顆粒,已經(jīng)相互融合形成前頂體囊(圖1-7)。2.4前后前積體積精細(xì)胞是次級精母細(xì)胞經(jīng)第二次成熟分裂產(chǎn)生的,前者體積明顯比后者小。根據(jù)其發(fā)育過程中染色質(zhì)凝集狀況、前頂體囊及線粒體形態(tài)位置的變化,可分為6個時期。2.4.1顆粒異染色法細(xì)胞橢圓形,大小約3.4μm×1.8μm。細(xì)胞核較大,核形與胞體一致,大小約為2.9μm×1.6μm。顆粒狀異染色質(zhì)變粗且均質(zhì)化。線粒體逐漸融合,數(shù)目減少,體積顯著增大。長約0.5μm,寬約0.34μm的橢圓形前頂體囊繼續(xù)發(fā)育,內(nèi)含電子密度較高的顆粒狀物質(zhì)。前頂體囊與線粒體共同分布于細(xì)胞的一端(圖2-1)。2.4.2核型設(shè)質(zhì)分子細(xì)胞呈圓形或橢圓形,大小約為3.0μm×2.8μm。核呈橢圓形,長徑約為2.0μm,短徑約為1.5μm,位于細(xì)胞中央。核內(nèi)顆粒狀染色質(zhì)不斷濃縮,局部區(qū)域仍聚集成團塊狀。細(xì)胞質(zhì)含量較多,內(nèi)含少量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。線粒體不斷融合,內(nèi)部基質(zhì)的電子密度增大,嵴的數(shù)量、長度都增加,并逐漸移向核后端。中心體發(fā)出胞內(nèi)鞭毛,也往核后端移動。前頂體囊繼續(xù)發(fā)育,并逐漸向預(yù)定的細(xì)胞核前端遷移,呈橢圓形,長約0.6μm,寬約0.45μm(圖2-2)。前頂體囊、細(xì)胞核、線粒體三者將位于一直線上,核前窩與植入窩明顯(圖2-3)。2.4.3密度和干物質(zhì)細(xì)胞體積減小,呈橢圓形,長約2.7μm,寬約1.8μm。細(xì)胞核大小約為1.7μm×1.4μm。異染色質(zhì)顆粒明顯增大且密度增高。前頂體囊臨核面中央向內(nèi)凹變扁,形成亞頂體腔,內(nèi)含低電子密度物質(zhì)。前頂體囊的內(nèi)含物分布不均勻,基部四周為高密度頂體物質(zhì),而其他區(qū)域的電子密度則較低,此時前頂體形成(圖2-4)。2.4.4胞核的測定和染色法細(xì)胞明顯延長,形態(tài)與精子相似,大小約為3.0μm×1.6μm。細(xì)胞核亦延長呈橢圓形,長約1.8μm,寬約1.3μm。粗顆粒狀染色質(zhì)完全連為一體,且較為均勻,電子密度增加,但有一些核泡。仍有較多的細(xì)胞質(zhì),其中含有少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。線粒體與前頂體繼續(xù)發(fā)育(圖2-5)。2.4.5高電子密度核及頂體細(xì)胞質(zhì)大量減少,細(xì)胞體積顯著減小,形態(tài)與精子基本一致,長約3.0μm,寬約為1.4μm。核進一步延伸,大小約1.6μm×1.2μm。核內(nèi)顆粒狀染色質(zhì)進一步濃縮,成為高電子密度的均質(zhì)物,仍存在少量核泡。前頂體及亞頂體腔向前延伸,形成頂體。細(xì)胞質(zhì)已大部分成為殘留體而被排棄,僅留一薄層細(xì)胞質(zhì)圍繞著精細(xì)胞(圖2-6)。2.5亞頂體及其他體體的結(jié)構(gòu)溝紋巴非蛤成熟精子呈長辣椒狀,為原生型,長約45μm,由頭部、中段和尾部三部分構(gòu)成。頭部長約3.0μm,由頂體和細(xì)胞核組成。頂體位于頭部最前端,呈現(xiàn)圓錐狀,長約0.9μm,最寬處約0.6μm。頂體內(nèi)含物分布不均勻,高密度頂體物質(zhì)集中分布于基部四周,頂體中其它空間為一些電子密度較低的均勻物質(zhì)所充滿。頂體外包有一連續(xù)的單層膜,按其位置的不同可分為頂體外膜和頂體內(nèi)膜,頂體外膜以一薄層胞質(zhì)與質(zhì)膜相隔;而頂體內(nèi)膜靠近亞頂體腔。亞頂體腔呈尖錐狀,幾乎伸達(dá)頂體的前端,位于頂體基部中央,內(nèi)含的亞頂體物質(zhì)電子密度較低(圖2-7)。細(xì)胞核卵圓形,大小約1.7μm×1.0μm。顆粒狀染色質(zhì)高度凝聚致密,可見一些不規(guī)則透明的核泡。細(xì)胞核與亞頂體腔相對處稍許凹陷,形成核前窩;與線粒體相鄰處由于球狀線粒體的嵌入,細(xì)胞核亦內(nèi)陷形成植入窩。與質(zhì)膜間有少量的細(xì)胞質(zhì)(圖2-8)。中段較短,長約1.0μm,最寬處約為1.5μm。由線粒體圍繞中心粒復(fù)合體形成主要結(jié)構(gòu)。中段橫切面上可見4或5個卵圓形線粒體圍繞在中心粒周圍(圖2-9)。線粒體電子密度較低,直徑約為0.5μm,由內(nèi)外兩層膜組成,內(nèi)膜向腔內(nèi)折疊形成極明顯的褶皺嵴突。中心粒復(fù)合體由相互垂直的近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒組成,兩者皆為中空的短圓筒狀結(jié)構(gòu)。尾部細(xì)長,約40μm,由軸絲和質(zhì)膜組成,軸絲由遠(yuǎn)端中心粒發(fā)出,為典型的“9+2”型結(jié)構(gòu),由中央的兩個單根微管和周圍的9個成對微管組成。3精子頂體的形態(tài)雙殼類軟體動物精子發(fā)生的基本過程一致,經(jīng)歷了從精原細(xì)胞→初級精母細(xì)胞→次級精母細(xì)胞→精細(xì)胞→最后變態(tài)為成熟精子的過程。各個階段形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化,因種類的不同而存在差異,在精原細(xì)胞階段一般沒有差別,但在精母細(xì)胞及精細(xì)胞階段則可明顯地體現(xiàn)出不同。精細(xì)胞尚不具有雄性配子的功能,需要經(jīng)過一系列的變態(tài)分化過程從而形成成熟的精子,才具備受精的能力。雙殼類軟體動物精細(xì)胞在分化形成精子的過程中主要經(jīng)過以下階段:1)精子細(xì)胞器的形成(包括頭部頂體,中段線粒體與中心粒,末段鞭毛);2)核的形態(tài)變化(包括核體積縮小,染色質(zhì)濃縮)。分化成熟的精子其形態(tài)結(jié)構(gòu)必須與動物的生殖方式及卵的形態(tài)結(jié)構(gòu)相適應(yīng)。根據(jù)受精方式的不同,軟體動物的精子可分為兩大類:原生型(Primitivetype)精子和修飾型(Modifiedtype)精子。其中,原生型精子是動物界中最普遍的,進行體外受精的精子一般都是原生型。溝紋巴非蛤精子具典型的原生型結(jié)構(gòu)。由頭部、中段和尾部三部分組成。不同種間同屬原生型的精子在形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在較大差異,這種差異主要表現(xiàn)在頭部的外形構(gòu)造上。精子頭部的形態(tài)主要由頂體的形態(tài)和核的形態(tài)決定。例如合浦珠母貝精子頂體呈現(xiàn)奶嘴形,核近圓形;貽貝精子的頂體呈長圓錐形,核卵圓形;中國淡水蟶精子頂體呈“⊥”形,核呈近圓形。某些種類精子的亞頂體腔還出現(xiàn)了板層小體或軸棒等復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。溝紋巴非蛤精子頂體呈圓錐狀,核近橢圓形,亞頂體腔中只有一些電子密度較低的亞頂體物質(zhì)。雙殼類軟體動物的頂體屬簡單頂體,大多頂體內(nèi)含物的電子密度均勻,例如,櫛孔扇貝(Chlamysfarreri);也有前中后端、內(nèi)外區(qū)電子密度有差別的,如大珠母貝、青蛤和西施舌(Coelomactraantiquata)。溝紋巴非蛤精子頂體結(jié)構(gòu)的特殊之處在于其頂體物質(zhì)分布不均勻,分布于頂體基部四周的頂體物質(zhì)電子密度高,而其它區(qū)域則密度較低。亞頂體腔中的亞頂體物質(zhì)電子密度較低。這與趙志江研究的波紋巴非蛤精子的頂體結(jié)構(gòu)不同。據(jù)他的觀察,波紋巴非蛤頂體外區(qū)電子密度比內(nèi)區(qū)大,亞頂體物質(zhì)分布于頂體與核之間,電子密度較高。存在這種差別可能與巴非蛤的系統(tǒng)演化及種屬差異有關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)溝紋巴非蛤由生精細(xì)胞發(fā)育分化成精細(xì)胞的過程中,高爾基體分泌的前頂體顆粒量增多,并逐漸融合,體積明顯增大形成前頂體囊。在精細(xì)胞變態(tài)成精子過程中,前頂體囊內(nèi)凹呈倒“U”字形,覆蓋在核一端。頂體物質(zhì)逐漸沉積于囊腔基部四周,電子密度增大,這時頂體也基本形成。由此可見,頂體的形成及其內(nèi)容物的合成和濃縮,是同高爾基體關(guān)系密切的。這進一步證實了汪德耀等關(guān)于動物雄性生殖細(xì)胞頂體由液泡演變成的觀點。此外,溝紋巴非蛤精子的亞頂體腔中沒有軸狀結(jié)構(gòu),而軸狀結(jié)構(gòu)在頂體反應(yīng)中起著重要的作用,作者推測內(nèi)含的亞頂體物質(zhì)可能起到與軸狀結(jié)構(gòu)相似的功能。在精子形成過程中,精細(xì)胞核形態(tài)變化和染色質(zhì)濃聚是有種屬差異的,Walker把各種動物精細(xì)胞核染色質(zhì)濃聚后的形態(tài)歸為三類:顆粒狀、纖維狀和片狀(晶體狀)。本研究中觀察的溝紋巴非蛤精細(xì)胞核染色質(zhì)濃度過程,不同于上述各種類型,而與波紋巴非蛤、西施舌類似,即由稀疏小團塊→細(xì)顆粒狀小團塊→粗顆粒狀小團塊→粗顆狀均勻分布→高密度的致密均質(zhì)物。不管染色質(zhì)最終變?yōu)閳F塊狀、顆粒狀還是均質(zhì)物,其游離的表面積都減少,這種縮小可以增強結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,利于受精功能的完成。隨著染色質(zhì)密度不斷遞增的濃縮過程的進行,核的形態(tài)由扁圓變似圓后延長成橢圓,同時體積逐漸縮小,這一過程與青蛤類似。核形態(tài)的改變與核內(nèi)染色質(zhì)變化密切相關(guān),核內(nèi)染色質(zhì)的高度濃縮和核體積的減小可能有利于精子迅速穿過卵膜與卵受精。線粒體是精子運動的能量供應(yīng)中心。Frazen認(rèn)為雙殼類軟體動物精子中段的線粒體形態(tài)和數(shù)目比較穩(wěn)定。從精原細(xì)胞發(fā)育到次級精母細(xì)胞,線粒體數(shù)量增多,嵴逐漸發(fā)達(dá),基質(zhì)電子密度也增高,集中在高爾基區(qū)的線粒體