不同時(shí)段睡眠剝奪大鼠下丘腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

不同時(shí)段睡眠剝奪大鼠下丘腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

0sd與睡眠剝奪腦癱是睡眠覺醒節(jié)律的中心部位，與神經(jīng)系統(tǒng)其他部位密切相關(guān)。作為神經(jīng)分泌物的中心，它可以調(diào)節(jié)一些激素的分泌規(guī)律。睡眠損害（sd）是指受試者的睡眠時(shí)間限制不得。近年來，sd對(duì)身體的影響引起了人們的關(guān)注，但sd與神經(jīng)實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)系研究較少。在本研究中，我們使用免疫組織化學(xué)方法，觀察不同時(shí)期sd后大腦中g(shù)fp的變化，并探討了星狀質(zhì)細(xì)胞對(duì)sd的反應(yīng)以及隨后的睡眠調(diào)節(jié)。1材料和方法1.1分組及分組成年、雄性、健康上海產(chǎn)Sprague-Dawley大鼠45只,體質(zhì)量(180±10)g,由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.將45只大鼠隨機(jī)分為3組,每組15只又隨機(jī)分為小平臺(tái)實(shí)驗(yàn)組(sleepdeprivationgroup,SD組)7只,大平臺(tái)對(duì)照組(tankcontrolgroup,TC組)7只及單獨(dú)籠養(yǎng)的空白對(duì)照組(cagecontrolgroup,CC組)一只;SD與TC各組內(nèi)7只大鼠分別隨機(jī)進(jìn)行3,6,12,24,48,72和96h睡眠剝奪處理.睡眠剝奪模型的建立,采用小平臺(tái)水環(huán)境法(flowerpot)建立大鼠SD模型.1.2方法1.2.1大、小鼠腦組織病理學(xué)檢查各組大鼠到實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)后立即腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg/kg)麻醉,開胸經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水100mL快速?zèng)_洗全身組織血液,隨后灌注冷的(4℃)40g/L多聚甲醛(pH7.4)500mL,先快后慢持續(xù)60~90min.灌注結(jié)束后取全腦置于200g/L蔗糖磷酸緩沖液(pH7.4)中,4℃冰箱保存至組織塊沉底.用恒冷箱切片機(jī)做連續(xù)冠狀冰凍切片,片厚30μm,隔5取1,切片收集于0.01mol/LPBS中.1.2.2生物素-卵白素-hrp物和丙綸的顯色工藝切片分為2組:第1組:抗GFAP免疫組化反應(yīng)(ABC法):室溫下,切片用3g/LTritonX-100液孵育30min;入兔抗GFAP抗體稀釋液(1∶3000,Sigma)孵育24h;生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)孵育2h;生物素-卵白素-HRP復(fù)合物,ABC(1∶500,Sigma)孵育2h;最后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳胺法顯色.以上每一步驟之后均用0.01mol/LPBS充分漂洗3次,每次10min;DAB顯色前后各用蒸餾水快速?zèng)_洗腦片3次.第2組:用PBS替代GFAP抗體,再按ABC法進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果為陰性.1.2.3細(xì)胞深染、胞體變大和突變粗主要采用顯微鏡下計(jì)數(shù)下丘腦各核團(tuán)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量并結(jié)合細(xì)胞形態(tài)的改變?nèi)缂?xì)胞深染、胞體變大和突起變粗來判定.具體判斷標(biāo)準(zhǔn):≥60為極強(qiáng)陽(yáng)性(ue0d3),40~59為強(qiáng)陽(yáng)性(+++),20~39為陽(yáng)性(++),5~19為(+),<5個(gè)為陰性(-).2sd118a的交叉定位SD組在實(shí)驗(yàn)后,GFAP在下丘腦各個(gè)核團(tuán)的表達(dá)均出現(xiàn)隨SD時(shí)段變化的趨勢(shì)(圖1).GFAP在交叉上核的表達(dá)在SD12~24h達(dá)到高峰,以后又降低;在弓狀核的表達(dá)于48h時(shí)最強(qiáng);在視上核的表達(dá)于開始即增強(qiáng),24h時(shí)達(dá)高峰,48h后又減弱;在室旁核的表達(dá)于24h時(shí)略增強(qiáng).TC組GFAP在各核團(tuán)的陽(yáng)性表達(dá)也略微增強(qiáng),但未見明顯隨時(shí)間變化的趨勢(shì)(表1).3周期生物有機(jī)溶劑下丘腦是較高級(jí)的調(diào)節(jié)內(nèi)臟活動(dòng)的中樞,調(diào)節(jié)體溫、營(yíng)養(yǎng)攝取、水平衡、內(nèi)分泌、情緒反應(yīng)、生物節(jié)律等生理過程.視交叉上核是日周期節(jié)律的控制中心,摘除雙眼而處于自由行走的大鼠,其睡眠白晝多于夜間的節(jié)律仍然存在,如再破壞其視交叉上核,這種日周期節(jié)律則完全喪失.在體或離體實(shí)驗(yàn)均已證實(shí),視交叉上核神經(jīng)元放電活動(dòng)呈現(xiàn)周期約為24h的晝夜節(jié)律性.本實(shí)驗(yàn)觀察到,SD后第1日,視交叉上核GFAP表達(dá)增強(qiáng)(特別是SD12~24h),以后又減弱,這表明在SD12h后大鼠視交叉上核的AS被激活,SD24h為一個(gè)完整的日周期生物節(jié)律紊亂,AS表達(dá)最高;SD24~96h,GFAP表達(dá)降低,可認(rèn)為大鼠視交叉上核對(duì)SD后的生物鐘節(jié)律的重新調(diào)整.我們研究表明,AS參與睡眠調(diào)節(jié),SD使動(dòng)物生物節(jié)律改變,這此與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致.弓狀核接受中縫核內(nèi)5-HT能神經(jīng)元的部分纖維投射,5-HT能神經(jīng)元的胞體主要集中在中縫核群,中縫核吻側(cè)5-HT遞質(zhì)系統(tǒng)受中腦網(wǎng)狀激動(dòng)系統(tǒng)的驅(qū)動(dòng),涉及睡眠的發(fā)生和慢波睡眠的維持,SD可增加中縫核5-HT能神經(jīng)元陽(yáng)性率,使該系統(tǒng)活動(dòng)增強(qiáng),而后者又可反饋抑制網(wǎng)狀激動(dòng)系統(tǒng)的作用.另外我們?cè)赟D后亦發(fā)現(xiàn)腦干中縫核的GFAP陽(yáng)性表達(dá)以及隨時(shí)間變化的規(guī)律性,說明在下丘腦和腦干中縫核之間的聯(lián)系參與SD后的一系列生理反應(yīng).本實(shí)驗(yàn)中弓狀核在SD48h時(shí)GFAP表達(dá)最強(qiáng)而后減弱的現(xiàn)象,說明下丘腦弓狀核接受腦干中縫核投射纖維后,AS激活并參與對(duì)睡眠節(jié)律的調(diào)節(jié).視上核主分泌垂體加壓素,對(duì)血壓和滲透壓的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用.實(shí)驗(yàn)中視上核GFAP表達(dá)在SD一開始即升高,24h達(dá)高峰而后降低,說明SD作為一種應(yīng)激原,視上核AS參與了應(yīng)激反應(yīng).室旁核不僅與視上核通過分泌抗利尿激素調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡而且含有許多促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素神經(jīng)元,因此它既有神經(jīng)內(nèi)分泌功能,又有典型的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用.實(shí)驗(yàn)中AS在室旁核的表達(dá)于24h時(shí)略增強(qiáng),可認(rèn)為是對(duì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)變化的反應(yīng).盡管有些下丘腦核團(tuán)在TC組GFAP表達(dá)也有所增強(qiáng),但未表現(xiàn)出與SD組相似的隨時(shí)間變化的趨勢(shì),可認(rèn)為由于活動(dòng)限制及隔離使大鼠的神經(jīng)內(nèi)分