替米沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因表達(dá)、一氧化氮磷酸化應(yīng)激水平的影響

替米沙坦對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2基因表達(dá)、一氧化氮磷酸化應(yīng)激水平的影響

高血壓是人類最常見(jiàn)的疾病，也是心臟疾病的主要危險(xiǎn)因素。血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)及其新近發(fā)現(xiàn)的催化酶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-convertingenzyme2,ACE2)是機(jī)體內(nèi)血管一氧化氮(nitricoxide,NO)生成與氧化應(yīng)激狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子,在高血壓病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。替米沙坦(telmisartan)為一種新型長(zhǎng)效的AngⅡ1型受體(AT1)的拮抗劑(ARB),已廣泛應(yīng)用于臨床治療高血壓患者,但其是否通過(guò)調(diào)控血管ACE2表達(dá)進(jìn)而在血管氧化應(yīng)激調(diào)控中發(fā)揮作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討替米沙坦(telmisartan)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverat,SHR)血管ACE2表達(dá)的影響及其參與血管保護(hù)功效可能的機(jī)制。1材料和方法1.1大鼠分組、給藥與灌胃給藥由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005]提供SHR大鼠24只及同源對(duì)照WKY(Wistar-Kyotorats,WKY)大鼠8只。將大鼠隨機(jī)分成4組,每組8只:WKY對(duì)照組(WKY-C);SHR對(duì)照組(SHR-C);低劑量替米沙坦治療組(SHR-L);高劑量替米沙坦治療組(SHR-H)。大鼠均為♂,9~10周齡,體質(zhì)量(250±30)g。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。替米沙坦由德國(guó)BoehringerIngelheim公司提供,溶解于無(wú)菌生理鹽水中,配制濃度為1g·L-1。大鼠每日灌胃給藥(telmisartan5或10mg·kg-1或安慰劑生理鹽水5mg·kg-1),為期10周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,麻醉處死大鼠,分離胸主動(dòng)脈迅速置于液氮,后轉(zhuǎn)入-80℃待測(cè)。1.2聚丙烯酰胺凝膠活化用Bradford法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈組織總蛋白濃度。采用常規(guī)的Westernblot法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈組織中ACE2蛋白與eNOS磷酸化水平。取40μg總蛋白進(jìn)樣于預(yù)灌制的8~10%聚丙烯酰胺凝膠中,100伏電泳2h,然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉2h后,將膜采用抗ACE2、eNOS一抗及抗磷酸化p-eNOS(Ser1177)一抗(美國(guó)SantaCruz及CellSignaling公司)孵育過(guò)夜。洗膜后接著室溫下將膜用二抗孵育1h30min,洗膜3次,每次10min。最后采用ECL試劑盒顯影曝光,對(duì)特異性條帶進(jìn)行半定量分析,同時(shí)采用α-tubulin蛋白作為內(nèi)對(duì)照。1.3no檢測(cè)條件采用硝酸還原酶比色法檢測(cè)主動(dòng)脈組織中硝酸鹽(NO3-)和亞硝酸鹽(NO2-)含量來(lái)間接反映各種條件刺激下大鼠主動(dòng)脈組織中NO水平。NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司,嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。采用Beckman可見(jiàn)光-紫外分光光度儀,在550nm條件下,0.5cm光徑比色測(cè)各管吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量。同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組,每個(gè)樣品檢測(cè)3次,取其平均值。1.4過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定大鼠主動(dòng)脈組織MDA含量,其原理是過(guò)氧化脂質(zhì)產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合,形成紅色產(chǎn)物,在532nm處有最大吸收峰。MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司,采用分光光度計(jì)測(cè)定收集主動(dòng)脈組織上清MDA含量,嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。1.5統(tǒng)計(jì)處理資料數(shù)據(jù)以表示,采用SPSS(16.0)軟件進(jìn)行分析處理。多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析;多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1低0.330.0.05s1.00.05如Fig1所示,與WKY大鼠相比,SHR大鼠主動(dòng)脈組織中ACE2蛋白水平明顯降低(0.39±0.05vs1.00±0.06,P<0.01)。與SHR對(duì)照組相比,替米沙坦低、高劑量治療組SHR大鼠主動(dòng)脈組織中ACE2蛋白表達(dá)均明顯上升(0.62±0.06,0.65±0.07vs0.39±0.05,P值均<0.05)。2.2nommolg-1pein與WKY對(duì)照組相比,SHR大鼠主動(dòng)脈組織中Ser1177-eNOS磷酸化水平明顯降低,伴NO水平下調(diào)(p-eNOS:0.43±0.06vs1.00±0.04;NOmmol·g-1protein:11.5±2.1vs27.8±4.9;P值均<0.01,Fig2、3)。而經(jīng)替米沙坦治療后,SHR大鼠(SHR-L與SHR-H組)主動(dòng)脈Ser1177-eNOS磷酸化表達(dá)和NO水平則明顯增加(p-eNOS:0.68±0.07,0.71±0.06vs0.43±0.06;NOmmol·g-1protein:19.2±3.3,23.9±3.2vs11.5±2.1;P值均<0.05,Fig2、3)。2.3替米沙坦治療shr的mtd-pcr檢測(cè)如Fig4所示,與WKY對(duì)照組相比,SHR大鼠主動(dòng)脈組織MDA含量上升(393.9±17.9vs186.3±14.5nmol·g-1protein;P<0.01)。而經(jīng)低、高劑量替米沙坦治療后,SHR主動(dòng)脈組織MDA含量則明顯降低(271.9±16.1,249.2±19.6vs393.9±17.9nmol·g-1protein;P值均<0.05)。3特殊途徑和特殊方式的mda和阿利克氏體的特殊作用活性氧族(reactiveoxygenspecies,ROS)增加及氧化應(yīng)激增強(qiáng)參與高血壓病的發(fā)生、發(fā)展,最終導(dǎo)致高血壓內(nèi)皮功能紊亂和心血管等靶器官損害。在腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)中,AngⅡ是心血管系統(tǒng)中ROS生成和氧化應(yīng)激的重要激活物。ROS參與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,引發(fā)血管炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及血管重塑等過(guò)程,最終導(dǎo)致高血壓病的發(fā)病。NO主要由內(nèi)皮來(lái)源的NO合酶eNOS催化L-精氨酸代謝生成,具有擴(kuò)張血管、抗炎癥、抑制細(xì)胞凋亡等作用,對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。機(jī)體內(nèi)心血管組織ROS的過(guò)度生成會(huì)降低NO的生物活性,削弱心血管組織的抗氧化能力,從而導(dǎo)致心血管組織損害。有趣的是,本研究發(fā)現(xiàn),與WKY對(duì)照大鼠相比,SHR大鼠血管組織中出現(xiàn)eNOS磷酸化水平下降,同時(shí)伴血管NO水平下調(diào)及MDA水平增加。MDA是細(xì)胞膜氧自由基連鎖反應(yīng)的終產(chǎn)物之一,其含量直接反映細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的速率和強(qiáng)度,代表細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。上述提示高血壓大鼠主動(dòng)脈組織中eNOS/NO體系下調(diào)可能導(dǎo)致抗氧化能力下調(diào),通過(guò)促進(jìn)MDA生成增加,導(dǎo)致高血壓大鼠血管組織氧化應(yīng)激增強(qiáng)。ACE2表達(dá)或活性異?？赡軈⑴c高血壓病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程,通過(guò)調(diào)節(jié)ACE2的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)為防治高血壓病及其并發(fā)癥的重要手段。在新的RAS中,ACE2可高效降解ACE的作用產(chǎn)物AngⅡ,使之生成Ang-(1-7);還可競(jìng)爭(zhēng)性地作用于ACE的底物AngⅠ,使之生成Ang-(1-9),后者經(jīng)ACE作用進(jìn)一步生成為Ang-(1-7)。Ang-(1-7)為一種較強(qiáng)的舒血管物質(zhì)肽,主要分布于心臟、血管、腎臟等處和血液中,通過(guò)結(jié)合Mas受體促進(jìn)緩激肽、前列腺素和NO的釋放,發(fā)揮其擴(kuò)血管、抗氧化及促凋亡等功效。ACE2基因通過(guò)拮抗AngⅡ的作用減少ROS生成,從而發(fā)揮一定的抗氧化功效。新近研究顯示,ACE2的過(guò)表達(dá)能改善小鼠NOS活性且增加NO信號(hào),從而降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平,而ACE2基因敲除小鼠出現(xiàn)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加,造成各組織氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn),與WKY對(duì)照大鼠相比,SHR大鼠血管組織中出現(xiàn)ACE2蛋白水平降低,同時(shí)伴有eNOS/NO體系下調(diào)及MDA增加。Zhong等新近研究證實(shí),AngⅡ可以導(dǎo)致小鼠心臟組織ACE2表達(dá)下調(diào),而ACE2基因缺失或表達(dá)減少可導(dǎo)致心臟和腎臟組織細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的活性增加,同時(shí)伴有白介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)增加,從而加重AngⅡ介導(dǎo)的心血管及腎臟組織氧化損傷。替米沙坦能通過(guò)選擇性地、不可逆地阻斷AngⅡ與其1型受體AT1結(jié)合,減少AT1受體所介導(dǎo)AngⅡ引起心血管的肥大、細(xì)胞增殖和血管氧化應(yīng)激生成,另外還可能反饋性增加AngⅡ與AT2受體的結(jié)合,進(jìn)而抑制心血管增殖及氧化應(yīng)激損傷,發(fā)揮其心血管保護(hù)作用。另外,替米沙坦具有特異性的苯丙咪唑環(huán)和異芳香基團(tuán),具備脂溶性強(qiáng)和組織穿透性高的特性,與AT1受體的親合力更高,從而對(duì)AngⅡ的拮抗作用更強(qiáng)、更持久。本研究結(jié)果顯示,長(zhǎng)期替米沙坦治療后,SHR大鼠血管組織中出現(xiàn)ACE2蛋白和eNOS磷酸化水平增加,同時(shí)伴血管NO生成增加及MDA水平降低,提示替米