abc免疫組織化學(xué)技術(shù)在自發(fā)性高血壓大鼠腦室觸液神經(jīng)元中的應(yīng)用

abc免疫組織化學(xué)技術(shù)在自發(fā)性高血壓大鼠腦室觸液神經(jīng)元中的應(yīng)用

在動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，有一個與腦脊液接觸的中樞神經(jīng)（csjn）。它們位于腦室腔、室管膜或腦實質(zhì)，它們通過細胞或突起與腦脊液接觸。CSFCN在腦脊液與腦組織之間起著信息交流的作用。由一氧化氮合酶(NOS)神經(jīng)元分泌產(chǎn)生的一氧化氮(NO)作為神經(jīng)中樞的一種信息分子,可直接彌散到周圍神經(jīng)元,調(diào)節(jié)周圍神經(jīng)元遞質(zhì)的釋放。有關(guān)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)第三腦室NOS-CSFCN的文獻報道較少。我們既往研究表明NOS與加壓素(VP)、催產(chǎn)素(OT)在SD大鼠第三腦室的CSFCN內(nèi)有共存現(xiàn)象。本實驗在此基礎(chǔ)上用還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶(NADPH-d)組織化學(xué)方法,對SHR的第三腦室內(nèi)NOS-CSFCN的分布及形態(tài)進行觀察,并結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)對NOS與VP在第三腦室CSFCN內(nèi)的共存進行了研究。1材料和方法1.1尾動脈收縮壓測定選用同母SHR成鼠5只(中國科學(xué)院上海實驗動物中心),鼠齡13周,體質(zhì)量200～220g,SD大鼠5只(南京醫(yī)科大學(xué)動物中心)作為對照,體質(zhì)量220～240g,雌雄不拘,在相同環(huán)境下用正常飼料喂養(yǎng)。血壓測量:室溫20℃,2組大鼠在清醒狀態(tài)下,于每日上午9時用尾筒法測定尾動脈收縮壓,測3次,連續(xù)測1周,取平均值。結(jié)果用x?±sx-±s表示,SHR收縮壓為(23.19±1.45)kPa,SD大鼠收縮壓為(13.87±1.26)kPa。經(jīng)t檢驗,P<0.05,可見SHR組血壓明顯高于正常對照組。1.2兔抗vp抗體NADPH-d(瑞士Roche公司);硝基四氮唑藍(NBT)(美國Amresco公司);兔抗VP抗體(美國Chemicon公司);生物素標記羊抗兔IgG(美國Vector公司);濃縮型DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)。1.3免疫組織反應(yīng)tri能力常規(guī)灌注、取材將含第三腦室的組織塊在恒冷箱中作冠狀連續(xù)切片(厚20μm),分3組貼片:(1)NADPH-d組織化學(xué)染色組;(2)VP免疫組織化學(xué)染色組;(3)NADPH-d+VP雙標染色組,即先行NADPH-d組織化學(xué)染色,再行VP免疫組織化學(xué)染色。染色:(1)與(3)組切片加入反應(yīng)液37℃避光孵育60min。反應(yīng)液的組成:0.1mol/L磷酸緩沖液(PB),pH8.0,含0.3%TritonX-100,0.6g/L硝基四氮唑藍(NBT),0.5g/LNADPH-d,反應(yīng)后用pH7.4的PBS充分漂洗。(2)與(3)組進行VP免疫組織化學(xué)反應(yīng):切片經(jīng)正常羊血清(1∶50)處理30min,兔抗VP血清(1∶5000)4℃孵育12h,PBS漂洗,ABC免疫反應(yīng),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液(0.05%∶0.01%)室溫孵育約15min,PBS漂洗終止反應(yīng)。對上述切片脫水封片,光鏡觀察,攝片,并在高倍鏡下計數(shù)。實驗結(jié)果用雙標細胞數(shù)占所有單、雙標陽性細胞總數(shù)的百分率來表示,兩組間用U檢驗,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。對照實驗另取1只SD鼠腦冠狀連續(xù)切片,分4套作對照實驗。分別作以下實驗,(1)抗體交叉實驗:①空白實驗:分別省去NADPH-d組織化學(xué)染色與VP免疫組織化學(xué)染色中的NADPH-d、兔抗VP血清,分別孵育切片;②置換實驗:用正常兔血清代替VP免疫組織化學(xué)染色中的兔抗VP血清。(2)呈色混合實驗:在NADPH-d組織化學(xué)染色程序結(jié)束后,切片經(jīng)PBS漂洗,然后直接進行VP免疫組織化學(xué)染色程序中的DAB/H2O2呈色步驟,以證實在NADPH-d組織化學(xué)染色后是否有殘余的NADPH-d、NBT與VP免疫組織化學(xué)染色程序中的DAB反應(yīng),從而導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物混雜。以上實驗結(jié)果陰性。2結(jié)果2.1nos-csfcn的分布按Swanson等命名自前向后依次為:視前區(qū)(MPA)、室旁核前大細胞亞核(amPVN)、室旁核內(nèi)側(cè)大細胞亞核(mmPVN)、室旁核后大細胞亞核(pmPVN)。上述4個平面2組大鼠的3V室壁均有NOS-CSFCN分布,且分布較為類似。自吻側(cè)向尾側(cè),分布呈由腹側(cè)部逐漸向背側(cè)部過渡遷移的特征:在MPA水平主要分布在第三腦室室壁的腹側(cè)部與底部;在amPVN水平第三腦室室壁的腹側(cè)部與背側(cè)部均有分布(附圖A);在mmPVN水平,多密集排列于第三腦室室壁背側(cè)或腹側(cè)與背側(cè)交界處;在pmPVN水平,主要分布在第三腦室室壁的背側(cè)部(附圖B)。另外,在Swanson等所描述的室旁核前小細胞部(PaAP)的第三腦室室管膜下層或室管膜內(nèi)可見大量NOS-CSFCN呈現(xiàn)由吻側(cè)向尾側(cè)有逐漸增多的趨勢,可達數(shù)層。NOS-CSFCN位于腦室室管膜內(nèi)和室管膜下或距室管膜一定距離處,但有突起伸入腦室,與腦脊液相接觸。NOS-CSFCN與室周核、室旁核(PVN)內(nèi)NOS陽性神經(jīng)元接觸密切。2.2陰血特性及陽性細胞的結(jié)構(gòu)及共存率在上述的平面范圍,2組大鼠第三腦室周圍也可見VP陽性CSFCN分布,VP-CSFCN在第三腦室的分布與NOS-CSFCN比較一致,形態(tài)也基本類似。雙標記神經(jīng)元細胞核及核周圍的細胞質(zhì)呈棕黃色,外周的細胞質(zhì)與突起呈藍褐色。兩者的比例在各細胞間存有差異,可分3種類型:NOS反應(yīng)優(yōu)勢型(NOS染色深,多數(shù)細胞體直徑特別大,可達30μm以上);VP反應(yīng)優(yōu)勢型(VP呈色深,細胞體直徑小于前者,約20μm);兩者均衡型(細胞體直徑居兩者之間)(附圖C)。觀察了5套雙重反應(yīng)切片,在MPA至pmPVN部位的第三腦室室壁所有反應(yīng)陽性的CSFCN中,SD組陽性細胞總數(shù)為347個,VP-NOS雙標神經(jīng)元數(shù)為42個,占總陽性細胞數(shù)的12.1%。SHR組陽性細胞總數(shù)為333個;VP-NOS雙標神經(jīng)元數(shù)為77個,占總陽性細胞數(shù)的23.1%。兩組大鼠共存率經(jīng)U檢驗,P<0.01,說明SHR組共存率較SD組高。其中以amPVN、mmPVN雙標神經(jīng)元數(shù)最多,兩種神經(jīng)元共存率也最高。絕大部分陽性細胞的胞體較大,為大細胞型。其形態(tài)有卵圓形、圓形、梭形和多角形等。陽性細胞可嵌入室管膜細胞之間,一端較寬闊,與腦脊液接近,另一端變細,伸入周圍的神經(jīng)組織(附圖D)。另有極少部分小細胞型NOS單標神經(jīng)元,細胞體多呈梭形,位于室管膜內(nèi)或室管膜下。3shr第三腦室csfcn與nos、vp的關(guān)系既往研究表明,CSFCN分泌的遞質(zhì)可以為經(jīng)典遞質(zhì)(如5-HT)、肽能(如VP、P物質(zhì)、膽囊收縮素)和氨基酸能(如GABA)遞質(zhì)。文獻報道在室旁核(PVN)平面,第三腦室側(cè)壁的室管膜上皮細胞之間,發(fā)現(xiàn)有個別VP陽性細胞,并可見有神經(jīng)元突起與上皮細胞接觸并伸入第三腦室腔內(nèi),認為VP神經(jīng)元具有感受腦脊液變化或直接向腦脊液釋放其分泌產(chǎn)物的功能。我們在對SHR第三腦室周圍的CSFCN的研究中發(fā)現(xiàn)(1)SHR第三腦室周圍的CSFCN與正常SD大鼠一樣也具有分泌NOS和VP的功能;(2)本實驗首次觀察到在SHR第三腦室的CSFCN中NOS與VP兩者具有共存性,且SHR組共存率較SD組高,提示中樞VP含量的異常增加可能與高血壓發(fā)病有關(guān);(3)SHR第三腦室的NOS、VP、NOS-VP3種陽性CSFCN與腦脊液、PVN內(nèi)陽性細胞關(guān)系密切。在血壓的調(diào)節(jié)方面,NO和VP之間存在一種平衡機制,該機制有待進一步研究。CSFCN與腦脊液的聯(lián)系是通過非突觸方式進行的,既有吸收腦脊液內(nèi)物質(zhì)又有分泌物進入腦脊液的功能,還可感受腦脊液壓力及其內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子的變化,并將這些信息傳給不同腦區(qū)。本研究發(fā)現(xiàn)位于SHR的PVN的NOS、NOS-VP陽性神經(jīng)元有突起經(jīng)室管膜突入第三腦室,提示SHR的這些神經(jīng)元所產(chǎn)生的NO、VP也可直接釋放入腦脊液,并將感受腦脊液各種物質(zhì)的變化信息傳給不同腦區(qū)。本實驗闡明