幾種檢測(cè)纖維素的方法比較

幾種檢測(cè)纖維素的方法比較

關(guān)于木霉等低質(zhì)量細(xì)菌纖維素酶的研究報(bào)道很多。已經(jīng)報(bào)告的纖維素酶的測(cè)定方法也很多，包括棉線法、濾紙?zhí)?、cmc-t閾值降低法、染色纖維法、平板法和羧甲基纖維鈉酶活性法。對(duì)具有較強(qiáng)對(duì)維生素分解能力的微生物（如細(xì)菌）的酶活性、酶活性和活性機(jī)制的研究較少，因此這些規(guī)則不適用于其他低質(zhì)量的微生物。但目前對(duì)于這些方法測(cè)定的具體數(shù)值的可信度、可比性，卻沒有相關(guān)的報(bào)道研究。本次實(shí)驗(yàn)對(duì)報(bào)道較多的4種方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究這些實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)定性，從而為實(shí)驗(yàn)研究提供一定的參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1光光度計(jì)和工物用量HH-6型恒溫水浴鍋;22PC型分光光度計(jì);HG1001型電熱鼓風(fēng)干燥箱;FA2004型電子分析天平;UV-2401型紫外雙光束分光光度計(jì)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1試劑的制備1.2.1.l冰醋酸鈉溶液6醋酸-醋酸鈉緩沖液：11.8mL冰醋酸定容至100mL，稱取27.2g的醋酸鈉溶解并定容至100mL，將上述兩種溶液等體積混合。1.2.1.結(jié)晶酚溶液的配制稱取3,5-二硝基水楊酸6.3g于500mL大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后加入2mol/LNaOH溶液262mL，再加入到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g無水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后移入1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1000mL，貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。1.2.1.3-3c-na溶液稱取0.625g羧甲基纖維素鈉，加熱溶解，定容至100mL。1.2.2酶活性測(cè)定1.2.2.葡糖糖的制備原理：3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的強(qiáng)度成比例關(guān)系，利用分光光度計(jì)測(cè)出其在520nm處的吸光度，得出還原糖的量。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，稱取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100mL。取16支具塞試管，依次編號(hào)為0,1,2,3,4,5,6,7并作平行實(shí)驗(yàn)。由于各種方法反應(yīng)體系的總體積不同，所以需作不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所加的量也有所不同?，F(xiàn)以總體積為9mL體系為例：搖勻后置于沸水浴中加熱5min后，冷卻定容至25mL。搖勻后以0號(hào)管為對(duì)照于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以葡萄糖含量μmol為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2.維素酶液的配制配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)酶液：用去離子水100mL來溶解100mg纖維素酶（≥1000IU），配制成1mg/mL酶液。測(cè)定時(shí)分別吸取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL上述酶液用水補(bǔ)足至1mL，即為不同濃度的酶液。1.2.2.葡萄糖mol數(shù)的檢測(cè)濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中等”的纖維性材料，以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來表征纖維素酶系總的糖化能力的方法，此方法應(yīng)用廣泛，它反映了三類酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱濾紙酶活(FilterPaperActivity,FPA)。方法：取1mL酶液加1mL0.1mol·L-1、pH4.6的醋酸緩沖液，預(yù)熱到50℃，加入1條1×6cm新華濾紙(50±1mg)，50℃保溫1h。取出，沸水浴滅活5min，冷卻至室溫，用3mLDNS試劑顯色后稀釋3倍，測(cè)OD值(520nm)。OD值越大，說明該菌株的酶活力越強(qiáng)。酶活力計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；其中：60為保溫時(shí)間(酶與底物作用時(shí)間，min)；Ew為粗酶液的體積(mL)；u是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.2.粗酶活力測(cè)定原理：纖維素酶對(duì)CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作標(biāo)準(zhǔn)液，22PC分光光度計(jì)在520nm處測(cè)其吸光度，以每分鐘生成相當(dāng)于1μmol的葡萄糖為一個(gè)酶活性單位。取3支帶有20mL刻度的試管，1支管作空白對(duì)照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1mL酶溶液，置于50℃水浴鍋中預(yù)熱2min，然后在3支試管中分別加入4mL已預(yù)熱至50℃的底物溶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)5min取出，每管立即分別加入1mL2mol/L氫氧化鈉溶液和2mLDNS顯色液，搖勻后在對(duì)照管中再加入1mL酶液。將3支試管放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20mL，于520nm處測(cè)OD值。酶活力計(jì)算：從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；其中：5為保溫時(shí)間(酶與底物作用時(shí)間，min)；Ew為粗酶液的體積(mL)；u是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.2.吸光度的測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)使濾紙染色酶解后在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)釋放的著色物的吸光值，代表酶活，以吸光度為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)做曲線。在實(shí)際測(cè)定時(shí)，先利用紫外雙光束分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在536nm處吸收峰最高，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)以此波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。1.2.2.底物粘度測(cè)定底物溶液9mL，加酶液1mL,40℃，測(cè)定底物粘度減至一半時(shí)所需時(shí)間，以奧氏粘度計(jì)測(cè)定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作為一個(gè)單位。2結(jié)果與分析2.1葡糖糖的測(cè)定實(shí)驗(yàn)中所用的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線繪制結(jié)果如下：由于在以后的測(cè)定中，各方法的反應(yīng)體系并不相同，所以每個(gè)體系須有各自的葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線作為今后的參照。CMC糖化力測(cè)定參照?qǐng)D1，有三條曲線，是因?yàn)樵诔Ｓ脺y(cè)定中酶與底物不同，而造成它們各自體系的溶液的總體積也不相同，因此此方法的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線有三條。濾紙法參照?qǐng)D2。所得三條曲線的回歸方程如下：所得曲線的回歸方程：2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較酶活測(cè)定方法結(jié)果比較如下：所得曲線的回歸方程：所得曲線的回歸方程：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用標(biāo)準(zhǔn)纖維素酶所做的CMC酶活測(cè)定和濾紙酶活測(cè)定，從回歸曲線可以看出他們的線性較好，可以充分說明這2種方法比較穩(wěn)定。而且CMC酶活測(cè)定法和濾紙酶活測(cè)定法在很多報(bào)道中均在采用，這樣使實(shí)際實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更具可比性。所得曲線的回歸方程：所得曲線的回歸方程：由上述結(jié)果可知：CMC粘度降低法的線性沒有濾紙酶活測(cè)定法和CMC酶活測(cè)定法來得好，而且在實(shí)驗(yàn)過程中，兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)之間有較大的誤差。但從回歸方程就能看出，該方法的穩(wěn)定性較其他3種方法有很大的偏差。3測(cè)定方法的比較本次實(shí)