氧化苦參堿對rbl-2h3細胞分泌電池組和nf-的影響

氧化苦參堿對rbl-2h3細胞分泌電池組和nf-的影響

氧化苦參堿（oxy）是中藥（如紫草）提取的重要活性成分?？鄥⑹侵嗅t(yī)治療變質(zhì)尤其是i型變窄的常用藥物。肥大細胞(MC)是I型變態(tài)反應速發(fā)相的主要靶細胞,也是I型變態(tài)反應性炎癥的主要啟動細胞。為探討Oxy治療變態(tài)反應性疾病的作用機制,我們觀察了其對RBL-2H3肥大細胞活化分泌組胺和TNF-α的影響。1材料和方法1.1藥品、試劑與檢測試劑1640(Sigma),Hepes(Amresco),L-谷氨酰胺(武漢天遠生物技術(shù)有限公司),標準新生小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),Oxy(標準品,購自武漢市藥檢所),色甘酸鈉(Sigma),MTT(Amresco),Compound48/80(C48/80,深圳晶美),二甲基亞砜(DMSO,分析純),臺盼藍(Sigma),胰蛋白酶(Amresco),大鼠TNF-αELISA檢測試劑盒(深圳晶美),大鼠組胺ELISA檢測試劑盒(DR.Lab.CaliforniaUSA),EDTA(分析純)。1.2rbl-2h3細胞大鼠嗜堿性白血病細胞系(basophilicleukemiacellline)RBL-2H3細胞(第二軍醫(yī)大學全軍臨床免疫中心李莉博士贈)。1.3細胞培養(yǎng)實驗RBL-2H3細胞在含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng),3d傳代1次。取對數(shù)生長的細胞,臺盼藍排斥染色活細胞率>95%,進行實驗。用C48/80(終濃度為10μg/mL)誘導RBL-2H3細胞活化脫顆粒。1.4對oq值的檢測實驗步驟參照細胞培養(yǎng)1。RBL-2H3細胞密度為2×106/mL,Oxy起始濃度為3.2mg/mL,最后在酶標儀上檢測OD490值,各組的吸光值均減掉未加細胞和藥物的本底。檢測結(jié)果按公式計算:細胞增殖抑制率=(1-加藥細胞吸光值)/對照細胞吸光值×100%。1.5rb-2h3對rbl-3有影響(1)不加藥物對rbl-2h3細胞tnf-表達的影響Oxy(終濃度為100、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL)5個劑量組,2個色甘酸鈉(終濃度為0.1、0.5mg/mL)對照組,不加藥物的作為陽性對照組,不加藥物及C48/80作為空白對照組。根據(jù)預實驗的結(jié)果,加入C48/80激發(fā)RBL-2H3細胞后,培養(yǎng)上清液中TNF-α的分泌在60min達高峰,組胺在30min達高峰,所以選擇在RBL-2H3細胞激活60min及30min后檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α及組胺的分泌量。每組三個復孔,實驗重復一次。(2)對天氣形勢法檢測細胞外證據(jù)中各成分配的促進RBL-2H3細胞用0.25%胰蛋白酶-0.03%EDTA消化離心(1000r/min,5min),無鈣無鎂PBS輕輕洗滌細胞3次,用含鈣離子3mM的RPMI1640調(diào)整細胞密度為1.5×106/mL,激發(fā)實驗在Ep管內(nèi)完成。每個Ep先加入200μL單細胞懸液,然后加入含鈣離子3mM的RPMI1640培養(yǎng)液及Oxy及色甘酸鈉至總體積300μL,陽性對照組及空白對照組加入相應量含鈣離子3mM的RPMI1640培養(yǎng)液。預培養(yǎng)60min后加入C48/803μL進行激發(fā),空白組加入含鈣離子3mM的RPMI1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)60min后冰浴終止反應,離心(4℃,1500r/min,5min)后取上清裝入Ep管,作為檢測TNF-α的標本。重復上述步驟,培養(yǎng)30min后冰浴終止反應,離心(4℃,1500r/min,5min)后取上清液作為檢測細胞外組胺的標本,離心后的細胞加入300μLRPMI1640培養(yǎng)液混勻,反復凍融,離心(4℃,1500r/min,5min)后取上清作為檢測細胞內(nèi)組胺的標本。標本-20℃下保存。檢測結(jié)果按公式計算:組胺釋放率=[上清液中組胺濃度/(上清液中組胺濃度+細胞內(nèi)組胺濃度)]×100%;組胺抑制率=[(陽性對照組組胺釋放率-處理組上清液中組胺釋放率-空白對照組組胺釋放率)/(陽性對照組組胺釋放率-空白對照組組胺釋放率)]×100%;TNF-α抑制率=(陽性對照TNF-α濃度-處理組TNF-α濃度)/陽性對照TNF-α濃度×100%1.6檢測組和tnf-i的試驗用ELISA法檢測組胺及TNF-α,嚴格按照試劑盒操作步驟進行。1.7統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果2.1胞增殖的穩(wěn)定性Oxy高濃度時對RBL-2H3細胞增殖有抑制作用,低濃度時對RBL-2H3細胞的增殖有輕到中度刺激作用,并呈濃度依賴性,見圖1。經(jīng)CurveExpert1.3軟件分析Oxy的IC50值為0.95mg/mL。因此,下一步實驗中Oxy選取的5個濃度為100、10-1、10-2、10-3、10-4mg/mL。2.2rb-2h3細胞的活動過渡酶誘生組的結(jié)果是tnf-(1)rbl-2h3細胞激活前后各時間點者適應變量的關系經(jīng)t檢驗,Oxy抑制激活的RBL-2H3細胞釋放組胺作用不弱于色甘酸鈉,見表1。經(jīng)相關與回歸分析RBL-2H3細胞激活后組胺釋放抑制率與Oxy濃度的對數(shù)呈負相關,皮爾遜相關系數(shù)為-0.992(P=0.000<0.01),回歸方程為Y=0.645-0.146(-lgX)(P=0.001<0.01),見圖2。(2)tnf-激活的rbl-2h3細胞Oxy在100mg/mL對TNF-α釋放的抑制率達(77.64±0.02)%。經(jīng)t檢驗Oxy抑制激活的RBL-2H3細胞釋放TNF-α作用不弱于色甘酸鈉,見表2。經(jīng)相關與回歸分析,RBL-2H3細胞激活后釋放TNF-α抑制率與Oxy濃度的對數(shù)呈負相關,皮爾遜相關系數(shù)為-0.976(P=0.000<0.01),回歸方程為Y=4.160-4.965(-lgX)(P=0.005<0.01),見圖3。3oxi與mc活化脫顆粒肥大細胞是I型變態(tài)反應的重要中介細胞和許多炎癥反應后期的效應細胞,其在病理過程中的作用遠超過其在過敏反應中作為效應細胞的作用2。組胺主要存在于MC和嗜堿粒細胞的顆粒中,是變態(tài)反應性皮膚病的重要致病介質(zhì),可以引起皮膚和黏膜毛細血管擴張、血管通透性增加;嗜酸粒細胞趨化作用3,4。MC既可預先形成TNF-α并貯存于其顆粒內(nèi),也可激活后新合成TNF-α并迅速大量釋放5。MC分泌組胺及TNF-α的量均可反映MC活化及脫顆粒以及相關前炎癥細胞因子的合成和分泌強度,是MC活化及脫顆粒的重要標志。RBL-2H3細胞是大鼠嗜堿性白血病細胞株的一個亞系,能模擬MC的多種功能,是體外研究與MC有關的各種生理、病理、藥物作用機制等的重要模型6。抗原IgE復合物、C48/80等可通過不同途徑活化RBL-2H3細胞,導致組胺、TNF-α、白介素等的釋放7?？鄥⑹侵嗅t(yī)治療I型變態(tài)反應的常用藥物,Oxy是中藥苦參等提取的一種重要的喹諾里西啶類生物堿,可顯著減輕小鼠哮喘模型病變組織中嗜酸粒細胞的浸潤,抑制哮喘小鼠肺組織中IL-4mRNA的表達,具有抗氣道變應性炎癥的作用8。Oxy還可抑制遲發(fā)性變態(tài)反應,抑制同系細胞抗體介導的MC脫顆粒9。我們的實驗表明:Oxy在較低濃度時即可抑制經(jīng)C48/80激活的RBL-2H3細胞釋放組胺和TNF-α,這種抑制作用不弱于色甘酸鈉,且組胺、TNF-α釋放的抑制率與Oxy濃度相關;與MTT的結(jié)果對照,Oxy的這種抑制作用與其抑制RBL-2H3細胞的增殖作用關系不大。殷金珠10等的研究表明Oxy能抑制IgE誘導的小鼠腹腔MC活化脫顆粒,認為Oxy的作用機制可能是提高細胞膜穩(wěn)定性,影響細胞膜表面IgE受體橋聯(lián),從而