自噬研究的相關(guān)知識(shí)

、自噬溶酶體系統(tǒng)2021/10/10

1什么是自噬?自噬

(autophagy)

性細(xì)胞死亡，是凋亡和壞死之外的第三種程序性細(xì)胞死亡方式.自噬是真核生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守一類

降解途徑，通過(guò)形成雙層膜的自噬體，將蛋

白質(zhì)等生物大分子或細(xì)胞器(線粒體等)回

收至溶酶體將其降解為氨基酸、單糖等小分

子，實(shí)現(xiàn)循環(huán)再利用。自噬體的半衰期8

min左右，是細(xì)胞對(duì)于環(huán)

境變化的有效反應(yīng)。2021/10/10

2細(xì)胞自噬的分類——根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)到溶酶體內(nèi)的途徑不同1

、巨型細(xì)胞自噬

(macroautophagy),

又稱為大自噬，

是指細(xì)胞內(nèi)新生的球狀脂質(zhì)雙層包裹胞漿蛋白和細(xì)胞

器，并運(yùn)送到溶酶體降解的自噬行為。2

、微型細(xì)胞自噬

(microautophagy),

又稱為小自噬，

是指通過(guò)溶酶體膜的內(nèi)陷、突起和/或分隔，直接吞

入細(xì)胞漿的自噬行為。3

、分子伴侶介導(dǎo)的細(xì)胞自噬(chaperone

mediatedautophagy,CMA),

是指由分子伴侶將靶蛋白轉(zhuǎn)送至溶

酶體內(nèi)的自噬行為。這只見(jiàn)于哺乳類動(dòng)物細(xì)胞。2021/10/10

3溶酶體異體吞噬內(nèi)吞作用質(zhì)膜2021/10/10

4蛋白酶體LAMP-2A胞質(zhì)分子伴侶自

吞

復(fù)合體分子伴侶介導(dǎo)的細(xì)胞自噬泛素-蛋白酶體系統(tǒng)微型細(xì)胞自噬巨型細(xì)胞自噬前自噬體胞質(zhì)蛋白自吞小泡細(xì)胞質(zhì)泛素WControl

StarvationLC3ILC3Ⅱ500

nmAutophagy

is

a

cellular

degradation

system

in

which

cytoplasmiccomponents,

including

organelles,

long-life

protein

are

sequestered

by

double-membrane

structures

called

autophagosomes

a

nd

the

sequestered

materials

are

degraded

by

lysosomal

hydrolases2021/10/10

5Autophagy基礎(chǔ)自噬和誘導(dǎo)自噬基礎(chǔ)自噬：

是一種在大多數(shù)細(xì)胞中持續(xù)發(fā)生對(duì)較低的細(xì)胞自噬過(guò)程，對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的更環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持具有不可或缺的作用。誘導(dǎo)自噬：

是細(xì)胞應(yīng)對(duì)外界刺激的一種保

少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或能量、受到氧脅迫等情況下，

水平在短時(shí)間內(nèi)劇烈升高的細(xì)胞自噬過(guò)程。如哺乳動(dòng)物出生后初期，由于母體不再提供營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，幼體的細(xì)

胞自噬非常活躍，這為維持其生命活動(dòng)起了非常重要的作用。2021/10/10

6自噬進(jìn)程1、

自噬的誘導(dǎo)激活2、

自噬體的成核和延伸3、

自噬體與溶酶體融合4、

內(nèi)容物降解Sequestration

Vesicle

formation

Fusion

DegradationPhagophore

Autophagosome

AutolysosomeLysosome第一步：

自噬的誘導(dǎo)一系列自噬相關(guān)基因

(autophagy-related

gene,Atg)

組成的復(fù)合體參與調(diào)控自噬體的形成。主要是Atg1/ULK1

復(fù)合體，包括Atg1

、Atg13

、Atg17,mTORC1

磷酸化Atg1/ULK1和Atg13抑制自噬的起始。mTORC1

失

活

=

>ULK1

去

磷

酸

化

-

>

自噬激活2021/10/10

8p150Vps34

Becn1AutophagosomeAutophagosome2000

GENES&

DEVELOPMENT2021/10/10

9mTORAMPKULK1/2

ATG13FIP200

ATG10LysosomeATG5

ATG②ATG16LINITIATION

ELONGATION

CLOSURE

MATURATION

DEGRADATIONcargoLC3-

1-Lysosomal

enzymesIsolation

Membrane(Preautophagosome/

Phagophore)inductionAutolysosomeIsolation

Membrane

JumpyMTMR3Atg14-Vps34-beclin1

complexAtg14-Vps34-beclin1

complexJumpyMTMR3OmegasomeULK1-Atg13-FIP200-Atg101

complexANTIOXIDANTS

&

REDOX

SIGNALINGVolume

14,

Number

11,2011Atg12-Atg5/

Atg16

complex1.Initiation2021/10/10Nucleus第二步：

自噬體的成核，

細(xì)胞在接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)后，在胞漿中形成一個(gè)小的膜樣結(jié)構(gòu)：分離膜(isolation

membrane,IM),

然后不斷向兩邊延伸，成扁平狀，被稱為前自噬體(pre-

autophagosome

PAS)

,

是自噬發(fā)生的標(biāo)志之一。需要Atg6(Beclin1)-ClassⅢ

PI3K

復(fù)合體以及Atg12-Atg5-Atg16L

復(fù)合體.形態(tài)特點(diǎn)：

自噬前體多呈新月形或半環(huán)形，為游離雙層膜結(jié)

構(gòu)，兩層膜之間有腔。隨著自噬前體增大和包裹內(nèi)容物，內(nèi)

腔變得不明顯。多種ATG

蛋白參與自噬前體的組裝。組分來(lái)源：

來(lái)源于獨(dú)立形成的特殊膜結(jié)構(gòu)或線粒體、內(nèi)質(zhì)

網(wǎng)或高爾基復(fù)合體等膜結(jié)構(gòu)。2021/10/10

11p150Vps34

Becn1AutophagosomeAutophagosome2000

GENES&

DEVELOPMENT2021/10/10

12mTORAMPKATG13)

ULK1/2XFIP200

ATG101LysosomeATG5ATG16LINITIATION

ELONGATION

CLOSURE

MATURATION

DEGRADATIONcagoLC3-Lysosomal

enzymesIsolation

Membrane(Preautophagosome/Phagophore)inductionAutolysosome34

|

2021/10/10

13DsRed

ER

GFP-FYVE-TM24

min

32

min30|8

min280

min第二步：

自噬體膜的延伸，

自噬前體在兩個(gè)類泛素系統(tǒng)作用

下，包括Atg12-Atg5-Atg16L

復(fù)合體和LC3(Atg8)

作用下，LC3不斷接受PE,

擴(kuò)展膜的長(zhǎng)度，成為成熟的閉合自噬泡。形態(tài)特點(diǎn)：

自噬前體由半月形，不斷延伸成閉合的完整的雙

層膜結(jié)構(gòu)的圓形自噬泡，內(nèi)容物為不斷捕獲的待降解的衰老

的蛋白、細(xì)胞器、蛋白聚集體。LysosomeATG5ATG12ATG16LAutophagosomeAutophagosomeINITIATION20CLOSURE

MATURATION

DEGRADATIONAutolysosomeELONGATION14E2E1Atg12Atg16Atg12Atg5Atg5Atg12LC3-ⅡAtg12Atg5Aj16PASAig16Aig5Atg12PELC3-I

LC3-I-GlyAtg32021/10/10

15Atg10Atg12圖2-7

自噬小泡的延伸LC3-ⅡE2自噬的標(biāo)記物第三步：

自噬體與溶酶體的融合，被運(yùn)送到溶酶體，兩者的

生物膜融合，變成一個(gè)自噬溶酶體(atuolysosome)。形態(tài)特點(diǎn)：

多呈圓形或橢圓形。由于自噬體內(nèi)膜很快被降解，

在透射電鏡下自噬溶酶體常不易與其他形式的溶酶體區(qū)別。2021/10/10

16LysosomeAutophagosomeLysosomal

hydrolase

AutolysosomeVESICLE

BREAKDOWN

&

DEGRADATIONVESICLENUCLEATIONVESICLEELONGATIONlsolationmembraneDOCKING

&

FUSION第四步：

自噬溶酶體內(nèi)的酸性水解酶降解囊泡中的內(nèi)容物，

成為降解性自噬體(degradative

autophagic

vacuole)。米lysosomal

hydrolasesAtcphagosome3.Maturation4.Autophagosome-Lysosome

fusion2.ElongationAutolysosomeLysosome5.Degradation202

Omegasome

The

amount

of

LC3-

11

17Isolation

Membrane(Preautophagosome/

Phagophore)nucleus1.Initiation①自噬的誘導(dǎo)②自噬體的成核

和延伸③

自噬溶酶體

的形成④內(nèi)容物的降解質(zhì)膜自陸外延體Class

I

Ptdins3K

復(fù)合物ULK1/2復(fù)合物mAtg9LC3-II2021/10/10○

通

透

醇

酸

性

水

解

酶QOOCOP

Atg12-Atg5-Atg16L復(fù)合物

自噬溶酶體自噬囊泡自噬小體核內(nèi)體溶酶體181、mTOR

活性調(diào)節(jié)2、

胰島素(激活mtor;

抑制FoxO3)自噬2021/10/10

19自噬的調(diào)節(jié)應(yīng)激

缺氧Akt/PKB胰島素生長(zhǎng)因子受體營(yíng)養(yǎng)

充足mTORC1RhebmTORRaptor饑餓AMPKClassⅢ

PI3KULK1

復(fù)合體RapamycinIRS雷帕霉素作用的靶位點(diǎn)(Taget

of

rapamycin,TOR)是氨

基酸、

ATP

和激素的感受器，它

在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和自噬的發(fā)生過(guò)

程有重要作用。TOR(target

of

rapamycin)能感受細(xì)胞的多種變化信號(hào)，加強(qiáng)

或降低自噬的發(fā)生水平。細(xì)胞內(nèi)

ATP

水平、缺氧等細(xì)胞信號(hào)都可

直接或間接通過(guò)TOR

將其整合，從而改變細(xì)胞的自噬發(fā)生，應(yīng)對(duì)不

同的外界環(huán)境刺激。2021/10/10自噬調(diào)控的中心分子TOR(target

of

rapamycin)生長(zhǎng)因子受體激活劑活化ClassPI3KAkt

信

號(hào)

通路mTor注

：線粒體胞質(zhì)蛋白生長(zhǎng)因子

生長(zhǎng)因子受體RapamycinD.

自

噬

體

破

壞3MAWortmanninA.

誘

導(dǎo)BAtg1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，

哺乳動(dòng)物中同源蛋白ULK1,ULK1

以復(fù)合

物的形式存在，除了ULK1

本身，還包括mAtg13、FIP200

(一種與黏著斑激酶FAK

相互作用的蛋白)和Atg101。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)足夠時(shí)，哺乳動(dòng)物雷帕霉

素靶蛋白復(fù)合物1(

mTORC1)

與

Atg1/ULK1

復(fù)合物與結(jié)合，通過(guò)磷酸

化Atg1/ULK1

和ATG13

從而抑制自

噬

的

起

始

從

而

抑

制

自

噬

。在饑餓的條件下，

mTORC1

從

Atg1/ULK1

復(fù)合物上分離，從而誘導(dǎo)

自噬體的成核(Nucleation)和延伸(Elongation)。2021/10/10Atg9L囊

泡

?Beclin

1Bcl2ULK1-Atg13-

FIP200-Atg101復(fù)合物ER

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Beclin1-Atg14-Ambra1-Vps15-Vps34

(PI3K)Atg1/ULK1

蛋白激酶復(fù)合體胰島素生長(zhǎng)因子

氨基酸mTORC1ULK1

-Atg13

-FIP200-Atg101Exo84-exocyst引發(fā)自噬complexRalBAMPK(AMP-activated

protein

kinase)AMPK

是細(xì)胞中感受能量狀態(tài)調(diào)節(jié)代謝的一個(gè)蛋白激酶，在自噬

發(fā)生的調(diào)控中也發(fā)揮著重要的作用。低ATP水平狀態(tài)下(如饑餓或

缺氧)AMPK

能感受AMP

的水平變化而激活，從而磷酸化結(jié)節(jié)性硬化

復(fù)合體TSC2(tuberous

sclerosis

protein)加

強(qiáng)TSC1/2

對(duì)Rheb

的MAPK

/Erk1/2Signalingp53

/Genotoxic

StressGSK3)AMPK)energy

stressPI3K-I/Akt

SignalingAMPK的活性被抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。p150

ULKPI3KII

Atg13

FIP200AminoAcidsdulSignalin

gG

LTSC1/2RhebmTOR抑制，最終使mTORmTOR

RaptorPRAS40AutophagyAMP:

ATPAmino

acRapamycinBeclintAtg9/mAtg9Atg9是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)編碼跨膜蛋白的

At

g基因，

能通過(guò)影響膜泡運(yùn)輸對(duì)自噬發(fā)生起調(diào)控作用。

營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏

時(shí)，

Atg9

與Atg23、Atg27結(jié)合，將它們運(yùn)輸

至PAS;Atg9L囊

泡Beclin

12021/10/10mTORC1ULK1-Atg13-

FIP2

-

tg

0le1xULK1-Atg13-FIP200-Atg101復(fù)

合

物ER

內(nèi)

質(zhì)

網(wǎng)胰

島

素生

長(zhǎng)

因

子

氨

基引

發(fā)

自

噬Exo84-exocystBeclin1-Atg14-酸RalBBcl2在Atg5-Atg12-Atg16

連接系統(tǒng)中，首先

由Atg7(E1)活化Atg12;

然后將Atg12傳遞給類Atg10(E2)

最后，

Atg12

被傳遞到Atg5,

與Atg5

的Lys共價(jià)結(jié)合形成Atg12-

Atg5復(fù)合物。自噬發(fā)生時(shí)，

Atg16

和Atg12-Atg5結(jié)合，

Atg16

含有一個(gè)螺旋卷曲結(jié)構(gòu)

易于形成低聚物，使得其能把更多的

Atg12-Atg5連接起來(lái)形成巨大復(fù)合物。從

而可能為參與自噬泡形成的蛋白質(zhì)提供相

互作用的平臺(tái)。

自噬發(fā)生時(shí)，此復(fù)合物定

位于隔離膜上，參與

LC3-II的形成過(guò)程，從

面保講自噬泡膜的延長(zhǎng)。Atg5-Atg12-Atg16

復(fù)合物自噬發(fā)生過(guò)程中有兩組類泛素化修飾過(guò)程，分別發(fā)生在Atg5-

Atg12-Atg16

連接系統(tǒng)和Atg8/LC3

連接系統(tǒng)中，用于隔離膜的延長(zhǎng)和自噬泡的形成。自噬體Atq12Atg12-Atg7(E1樣酶)Atg12-Atg10(E2樣酶)Atg12-Atg5Atg12-Atg5-Atg16L1proLC3Atg4LC3LC3-Atg7(E1

樣酶)

LC3-Atg3(E2

樣酶)

LC3-PEDFCP1核粗粒體隔離膜Ato12-Atg5DFCP1需的。LC3

合成后，最初以pro-LC3

形式存在，然

后立刻被Atg4B

切割形成LC3-I。

自噬發(fā)生時(shí)

,

均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中的LC3-I

被

Atg7(E1)活化并與其形成硫酯鍵，然后被傳遞給Atg3

(E2)

,

并最終在Atg5-Atg12-Atg16

復(fù)合物

(E3)

的幫助下連接上一個(gè)PE

分子，形成具

有膜結(jié)合能力的LC3-II。Atg16L

的細(xì)胞定位決定了LC3

成熟的位置，并促進(jìn)LC3-II結(jié)合到

自噬泡上。Atg8/LC3LC3:

是酵母Atg8

分子在哺乳動(dòng)物中的同源物，是自噬

發(fā)生的一個(gè)標(biāo)志蛋白。功能：促進(jìn)自噬泡膜的延長(zhǎng)和融合，是自噬泡形成所必Atg12Atg12-Atg7(EI樣酶)Atg12?Atg10(E2

樣酶)Atg12-Atg5Atg12-Atg5-Atg16L1proLC3Atg4LC3LC3-Ata7(E1

樣酶)

LC3-Atg3(E2

樣酶)

LC3-PEDFCP1核粗粒體2021/10/10自噬體Atg12-Atg5隔離膜-Atg16LiATG6/Beclin-1自噬小泡的成核需要含有ATG6

(其哺乳動(dòng)物同源蛋白命名

為Beclin

1)的復(fù)合物，這個(gè)復(fù)合物能夠與第三類磷酸肌醇3激酶

VPS34

形成超級(jí)復(fù)合物并使其激活產(chǎn)生磷脂酰肌醇3磷酸。胰

島

素生

長(zhǎng)

因

子

氨

基

酸囊

泡Beclin1-Atg14-復(fù)

合

物2021/10/10ER

內(nèi)

質(zhì)

網(wǎng)Bc12PI3P

可以組裝一些含有PX

和FYVE

結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)到

早期自噬泡產(chǎn)生的位置，促

使自噬前體的形成。ULK1

-

Atg13FIP2

0o-Amtg

0le1x引

發(fā)

自

噬-RalBExo84-exocystmTORC1Ata9L多種自噬相關(guān)蛋白結(jié)合，傳遞自噬信號(hào)促進(jìn)自噬發(fā)生。1、

如與Atg14

結(jié)合形成Atg14-Vps34-

Vps15-Beclin1

復(fù)合物參與自噬泡的形成；2

、與VRAG結(jié)合形成VRAG-Vps34-Vps15-Beclin1

在自噬泡成熟和運(yùn)輸中起作

用。3

、

促進(jìn)產(chǎn)生磷脂酰肌醇-3-磷酸(PI3P),

PI3P可以組裝一些含有PX

和FYVE

結(jié)構(gòu)域

的蛋白質(zhì)到早期自噬泡產(chǎn)生的位置，促使自

噬前體的形成。2021/10/10Vps34/PI3K-Beclin1復(fù)合物Vps34

是哺乳動(dòng)物中的第III類PI3

K

。在Vps34

復(fù)合物中，

Vp

s34

因結(jié)合Vps15

而被激活，并進(jìn)一步結(jié)合Beclin1

形成Vps34-Vps15-

Beclin1復(fù)合體。胰

島

素功能：

自噬發(fā)生時(shí)，

Vps34-Vps15-Beclin

和

生長(zhǎng)因子

氨基酸ULK1-Atg13-

FIP200-Atg101復(fù)合物ER

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Atg9L囊

泡

?Beclin

1FIP200-Atg101complexBeclin1-Atg14-

Ambra1-Vps15-Exo84-exocyst引

發(fā)

自

噬ULK1

-Atg13

-mTORC1RalBBcl2自噬體v

mTORC1:

哺乳動(dòng)物的雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1v

Atg12/LC3:

兩種泛素樣加工系統(tǒng)，包裹自噬底物

形成自噬體。v

Atg12-Atg5-Atg16L1:與外膜結(jié)合，促進(jìn)伸展v

Atg5:

決定膜伸展方向v

LC3-

Ⅱ:

自噬體標(biāo)志分子,判斷誘導(dǎo)或抑制Atg12Atg12-Atg7(E1樣酶)Atg12-Atg10(E2樣酶)Atg12-Atg5Atg12-Atg5-Atg16L1Atg12-Atg5-Atg16Li復(fù)合物proLC3Atg4LC3LC3-Atg7(E1樣酶)LC3-Atg3(E2

樣酶)LC3-PELC3-PE

隔離膜DFCP1

OFCP1核粗粒體v

Atg9:

嵌膜蛋白來(lái)回循環(huán)

移動(dòng)活化該激酶復(fù)合物從

而產(chǎn)生自噬分隔膜。v

PE:磷脂酰乙醇胺28dlCd胰島素生長(zhǎng)因子

氨基酸mTORC1自噬的分子機(jī)制ULK1-Atg13-

FIP200-Atg101復(fù)

合

物Beclin1-Atg14-Atg9L

囊泡?Beclin

1Bcl2A

a1-

pi3s

-)5K1V復(fù)psmbrULK1-Atg13-FIP200-Atg101引發(fā)自噬Exo84-exocystcomplexER

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RalBSequestrationLC3-HAtg3

PEAtg7LC3-1P13K-I/AktSignalingAMPKAminoAcidsGβLSignalingPhagophoreAtg16Atg12Atg16Atg5MAPK

/Erk1/2Signalingp53/GenotoxicStressAutophagosomeLysosomeHBeclin1Atg14MembraneNucleationBcl-2Apoptosis

RubiconULKII

Atg13

FIP200mTOR

RaptorPRAS40dlp150PI3KAutophagolysosomeAtg10Atg7AMP:

個(gè)

ATPLysosomeFusionAtg4Atg5LC3g12NeurodegenerativeDiseasesType

ⅡDiabetesFatty

LiverInfectiousDiseasesAggregate-prone

proteinsAutophagyPhysiological

and

pathological

roles

of

autophagyInnateImmuneSystemCardiomyopathy2021/10/10ProteasomeCell

DeathdeathCancerAging30自噬的生物學(xué)意義1、

應(yīng)激功能細(xì)胞自噬是細(xì)胞在饑餓條件下的一種存活機(jī)制。在營(yíng)養(yǎng)充足條件下，自噬發(fā)生處于較低水平，僅在胞質(zhì)中去除受損和多余的細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，稱為

基本自噬。細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)缺失時(shí)，細(xì)胞立即啟動(dòng)自噬以維持胞質(zhì)

中氨基酸池的平衡，可通過(guò)合成新的蛋白質(zhì)、能量生成和促

進(jìn)糖異生來(lái)避免細(xì)胞“餓死”。2021/10/10

312、

防御功能在細(xì)胞受到致病微生物感染時(shí)，細(xì)胞自噬起

一定的防御作用。某些細(xì)菌和病毒可逃離異噬途徑，避免溶酶體

消化。李斯特菌屬、志賀桿菌屬、立克次體屬等的

細(xì)菌可通過(guò)降解異噬體膜逃入細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞能夠通

過(guò)自噬發(fā)揮先天性免疫作用，抵抗細(xì)菌入侵。結(jié)核

桿菌通常定居于異噬體內(nèi)，但可激活自噬途徑被溶

酶體酶殺死。自噬也可以將病毒核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)感受器上激活

天然免疫，還可以將病毒抗原遞呈給

MHC

類分子激活適應(yīng)性免疫，發(fā)揮抗病毒作用。2021/10/10

323、

維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)在骨骼機(jī)和心肌，細(xì)胞自噬有特殊的“看家”(house

keeping)

功能，幫助細(xì)胞漿成分，包括線粒體，進(jìn)行更新。4、延長(zhǎng)壽命細(xì)胞自噬可降解損傷的細(xì)胞器、細(xì)胞膜和變性蛋白等胞內(nèi)成

分。如果細(xì)胞自噬受損衰竭，細(xì)胞損傷就會(huì)堆積、累加，產(chǎn)生老

化。長(zhǎng)期減少熱量攝入，在一些物種能延長(zhǎng)壽命。2021/10/10

335、

參與控制細(xì)胞死亡及癌癥自噬樣細(xì)胞死亡

(autophagic

cell

death,ACD):在研究自噬與凋亡的關(guān)系時(shí)，人們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞死亡前

胞漿中存在大量的自噬體或自噬溶酶體，但這樣的細(xì)胞

缺乏凋亡的典型特點(diǎn)，如核固縮

(pyknosis),

核破裂、

細(xì)胞皺縮、沒(méi)有凋亡小體的形成等，被稱為自噬樣細(xì)胞

死亡，

它是一種新的細(xì)胞程序性死亡，為了與凋亡區(qū)別，

被命名為Type

II

cell

death,

相應(yīng)的，凋亡為Type

Icelldeath,

壞死為Type

III

cell

death。盡管這樣，但對(duì)于自噬是否是細(xì)胞死亡的直接原因

目前還存在很大的爭(zhēng)議。到底是自噬引起死亡還是死亡

時(shí)有自噬發(fā)生，但不是直接原因?2021/10/10

34細(xì)胞自噬與腫瘤自噬在腫瘤發(fā)生中的雙重作用，在多種人類腫瘤中

均存在自噬活性的改變。一方面，自噬可抑制腫瘤的發(fā)生：首先，

自噬可清除受損細(xì)胞器以避免有害的氧自由

基蓄積及突變的發(fā)生。其次，自噬可限制DNA

損傷，維持基因組完整性。

在永生化鼠腎上皮細(xì)胞中自噬活性降低可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，基因擴(kuò)增，染色體非整倍性，從而增加了致癌性

突變率，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。再次，自噬可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘發(fā)凋亡性細(xì)胞死亡。2021/10/10

35另一方面，

自噬通過(guò)限制細(xì)胞壞死和炎癥促使腫瘤細(xì)胞存活于代謝性應(yīng)激的環(huán)境中，這些腫瘤細(xì)胞所具有的高自噬活性能增強(qiáng)腫瘤對(duì)應(yīng)激的適應(yīng)性，

對(duì)腫瘤細(xì)胞在惡劣環(huán)境中的生存起到了一定的保護(hù)作用。當(dāng)快

速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)，實(shí)體腫瘤內(nèi)部血供不

良，癌細(xì)胞利用自噬機(jī)制對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)缺乏和缺氧，通過(guò)

降解胞內(nèi)蛋白質(zhì)及細(xì)胞器為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)

及能量，可能利于腫瘤細(xì)胞在低血管化的環(huán)境中生長(zhǎng)。2021/10/10

36自噬檢測(cè)技術(shù)1自噬性結(jié)構(gòu)的電鏡下形態(tài)學(xué)觀察---電鏡檢測(cè)自噬主要是基于辨認(rèn)自噬體結(jié)構(gòu)電鏡下可觀察到雙層膜的自噬體和單層膜的自噬溶酶體結(jié)構(gòu)，其中包裹著未被完全降解的胞漿成分。ERAViAVi400

nmAVdAvd400

nm缺點(diǎn)：電鏡觀察僅能證明

自噬性結(jié)構(gòu)的存在，

難以

反映自噬活性的強(qiáng)弱。初始自噬囊泡(Avi)降解自噬囊泡(AVd)2021/10/10400

nm500通過(guò)免疫熒光的方法檢測(cè)內(nèi)源性LC3

或轉(zhuǎn)染GFP-LC3

融合蛋白的表達(dá)，自噬誘導(dǎo)后的細(xì)胞表現(xiàn)為點(diǎn)狀聚集增.理論上，觀察到的點(diǎn)狀聚集的數(shù)目即為自噬體的數(shù)量，根據(jù)點(diǎn)狀聚集的密集程度可以判斷細(xì)胞自噬的情況。可以火總體上大致反映自噬的增加或減少2

基于自噬體標(biāo)記蛋白LC3

的檢測(cè)方法微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3),LC3-

Ⅱ

始終穩(wěn)定地保留在

自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來(lái)作為自噬體的標(biāo)記，2.1

通過(guò)構(gòu)建綠色熒光蛋白(GFP)

和LC3

的融合蛋白，通過(guò)熒

光顯微鏡就可觀察LC3在細(xì)胞中的定位。382.2LC3-

Ⅱ

的水平在某種程度上反映了自噬體的多少除了熒光顯微鏡觀察LC3

外，LC3

還是生化方法檢測(cè)自噬

體的有利工具。內(nèi)源性LC3-II的量在某種程度上可反映細(xì)胞自

噬活性。因此，通過(guò)免疫印記方法檢測(cè)LC3-

ⅡI信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)對(duì)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬活性進(jìn)行定量檢測(cè)。2021/10/10

39Control

StarvationLC3ILC3ⅡX-

iSNutrientMock

X

Know

downStarvationp62LC3X-actinX

depletion

promotes

autophagyLC32021/10/10controlβ401

2

3

4

5

6GFPInternal

Control

→ZUZT/T0/70

412.3

GFP-LC3剪切分析GFP-LC3

切割LC3

連同自噬體內(nèi)膜和內(nèi)容物一起被溶酶

體降解，但GFP

在溶酶體中僅表現(xiàn)熒光信號(hào)猝滅，

GFP

本身

并不被降解，在自噬性溶酶體降解后會(huì)釋放出游離的GFP.

有鑒于此，通過(guò)免疫印跡的方法檢測(cè)游離GFP

蛋

白的

出現(xiàn)即意味著自噬性降解的發(fā)生。ProteinX—→3

基于自噬性降解的檢測(cè)

“自噬潮”分析自噬潮是一個(gè)動(dòng)態(tài)連續(xù)的概念，涵蓋了自噬體的形成、自噬性底物向溶酶體的運(yùn)送以及在溶酶體內(nèi)降解的整個(gè)過(guò)程。優(yōu)點(diǎn)：

較單純自噬體檢測(cè)更能反映自噬活性，

“自噬潮”分析是反映自噬活性的可靠指標(biāo)。3.1長(zhǎng)壽命蛋白降解根據(jù)自噬機(jī)制主要負(fù)責(zé)降解長(zhǎng)壽命蛋白的特性，先讓細(xì)胞在

含有同位素標(biāo)記氨基酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間(數(shù)小時(shí)至數(shù)天),細(xì)胞在此期間合成的蛋白質(zhì)都將被同位素標(biāo)記，然后換成

不含同位素的培養(yǎng)基，讓一些被標(biāo)記的短壽命蛋白通過(guò)蛋白酶體途徑降解.在自噬誘導(dǎo)后，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清中釋放的自噬性降解產(chǎn)

物的放射性活度即可反映細(xì)胞自噬性降解的能力。2021/10/10

423.2

RFP-GFP-LC3

的溶酶體呈遞自噬誘導(dǎo)后，融合表達(dá)GFP-LC3

蛋白錨定于自噬體膜上并與自噬體一起與溶酶體融合，溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境可以導(dǎo)致GFP

熒光信號(hào)的猝滅，紅色熒光蛋白R(shí)FP

對(duì)酸性環(huán)境具有很好的耐受

性.借助于兩種熒光蛋白的這種差異，通過(guò)構(gòu)建RFP-GFP-LC3串聯(lián)體，