fos蛋白表達(dá)與母嬰分離相關(guān)性的研究

fos蛋白表達(dá)與母嬰分離相關(guān)性的研究

新生物期是兒童時期的一個特殊階段。新生物期（ms）的分離是刺激因素，是生命早期最常見的負(fù)性生活事件。如果新生父母剝奪了嬰兒和母親之間的接觸，這種方式會影響嬰兒的生長和發(fā)育。已證實(shí):新生兒期MS很可能使該嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的成熟被阻斷,導(dǎo)致覺醒調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、注意力和學(xué)習(xí)能力的終生損害,對心理行為造成不同程度的影響。本實(shí)驗通過研究幼鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)FOS蛋白表達(dá)與母嬰分離的相關(guān)性,探討母嬰分離對大鼠成年后行為影響可能的機(jī)制,為臨床上防治因新生期MS可能引起的危害及疾病提供理論依據(jù)。1對象和方法1.1大鼠分組及飼養(yǎng)新生清潔級SD大鼠共32只,雌雄各半(上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司)[實(shí)驗動物許可證號:SCXK(滬)2003-0003]。出生后當(dāng)天定為第1天,根據(jù)析因設(shè)計方案,根據(jù)出生后第2天按是否給予MS、6周齡時是否接受結(jié)直腸擴(kuò)張(colorectaldistention,CRD)刺激兩因素兩水平,采用隨機(jī)數(shù)據(jù)表法,將32只大鼠隨機(jī)分成4組,每組8只。A1B1組:新生期給予MS,并在6周齡時接受CRD;A1B2組:新生期給予MS,但在6周齡時未接受CRD;A2B1組、A2B2組同為對照組,A2B1組:新生期未給予MS,而在6周齡時接受CRD;A2B2組:新生期未給予MS,且在6周齡時未接受CRD。各組大鼠繼續(xù)鼠乳喂養(yǎng)至21d,第22天斷奶,第30天雌雄分籠,采用混合配方飼料喂養(yǎng)至6周,自由進(jìn)食飲水,每日更換飲水、飲料,保持大鼠生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。觀察大鼠每天進(jìn)食、飲水、活動及大小便情況,確保大鼠健康及避開各種傷害性刺激。1.2材料表面兔抗FOS單克隆抗體(批號l1106)和SABC試劑盒(批號45038),均北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。1.3方法1.3.1ms+nm新生大鼠出生后第2～14天,每天與母鼠分離3h(8∶00～11∶00am),即:將母鼠拎出放入一籠中,然后將新生大鼠放入另一籠中,移至另一鄰近房間,溫度保持在27～30℃,進(jìn)行MS,3h后將新生大鼠返回最初籠中與母鼠團(tuán)聚,連續(xù)13d。1.3.2預(yù)防安氏血壓計為保證大鼠健康且腸道清潔,實(shí)驗時操作順利,幼鼠在實(shí)驗前18h禁食不禁水,乙醚麻醉后,將外涂石蠟油的氣囊插入結(jié)直腸內(nèi),使氣囊末端深入肛門內(nèi)1.0cm,在肛門外1.0cm處用膠布將導(dǎo)管固定在鼠尾根部,導(dǎo)管經(jīng)三通管連接注射器和血壓計。將幼鼠置于有機(jī)玻璃觀察箱(20cm×6cm×8cm)中,幼鼠能自由前后活動但不能轉(zhuǎn)身,待幼鼠蘇醒并完全適應(yīng)環(huán)境30min后開始實(shí)驗。1.3.3抗pas酶活性1)FOS蛋白免疫組織化學(xué)染色,常規(guī)方法制備PVN和ACC腦組織切片后,應(yīng)用SABC免疫組織化學(xué)法對PVN和ACC切片進(jìn)行FOS染色,具體步驟如下:1)石蠟切片脫蠟至水;2)壓力鍋抗原修復(fù),PBS洗滌,2min×3次;3)3%H2O2室溫孵育5～10min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性;4)蒸餾水沖洗,PBS浸泡5min;5)滴加兔抗FOS抗體(1∶100稀釋),4℃過夜或37℃孵育1～2h;PBS洗滌,5min×3次;6)滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶100稀釋),37℃孵育30～60min;7)滴加SABC,室溫20min;PBS沖洗,5min×3次;8)顯色、沖洗,復(fù)染,封片。用PBS液代替一抗作為陰性對照。2)不同腦區(qū)FOS蛋白檢測,BX51型數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)(Olympus)對每張腦切片進(jìn)行圖像采集,放大倍數(shù)為40倍(像素4080×3072)。FOS蛋白陽性神經(jīng)元細(xì)胞核呈均勻黃至深棕色(FOS蛋白陰性神經(jīng)元為在細(xì)胞核周邊呈現(xiàn)淡藍(lán)色)。在相同倍數(shù)下,每張切片隨機(jī)選取3個視野,計數(shù)3個視野平均FOS陽性細(xì)胞數(shù)。1.4統(tǒng)計分析結(jié)果采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。2不同程度fos蛋白免疫陽性表達(dá)經(jīng)處理后腦區(qū)切片中可見FOS陽性神經(jīng)元細(xì)胞核呈均勻黃至深棕色,而在陰性對照組中下丘腦PVN及ACC內(nèi)神經(jīng)元均沒有棕色FOS蛋白表達(dá)。實(shí)驗中,4組幼鼠的下丘腦PVN和ACC內(nèi)神經(jīng)元均有不同程度的FOS蛋白免疫陽性(Fos-likeImmunoreactivity,FLI)細(xì)胞表達(dá)(圖1,2),A1B1組下丘腦PVN或ACC內(nèi)出現(xiàn)密集棕黃色免疫陽性產(chǎn)物,FOS陽性細(xì)胞多;A1B2組和A2B1組,下丘腦PVN或ACC內(nèi)均有免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色沉積在細(xì)胞質(zhì),FOS陽性細(xì)胞較多;A2B2組下丘腦PVN或ACC內(nèi)僅有極少量FOS陽性細(xì)胞,免疫陽性產(chǎn)物著色淺淡。2.1幼鼠機(jī)械免疫指標(biāo)情況新生期給予MS和幼鼠6周齡時接受CRD刺激兩種因素均使幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)表達(dá)增加。新生期MS的主效應(yīng)為10.03,即新生期給予MS使幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)平均增加10.03個;幼鼠6周齡時接受CRD刺激的主效應(yīng)為22.45,即幼鼠6周齡時接受CRD刺激使幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)平均增加22.45個(表1)。幼鼠下丘腦PVN內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)受到新生期是否給予MS以及幼年期是否接受CRD刺激的影響;新生期給予MS和幼年期接受CRD刺激,均導(dǎo)致其下丘腦PVN內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)明顯增多。新生期給予MS與幼年期接受CRD刺激,兩者之間無明顯交互作用(表2)。2.2幼鼠acc內(nèi)fli細(xì)胞數(shù)變化新生期給予MS和幼鼠6周齡時接受CRD刺激兩種因素均使幼鼠ACC內(nèi)FIL細(xì)胞數(shù)表達(dá)增加。新生期MS的主效應(yīng)為18.38,即新生期給予MS使幼鼠ACC內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)平均增加18.38個;幼鼠6周齡時接受CRD刺激的主效應(yīng)為14.98,即幼鼠6周齡時接受CRD刺激使幼鼠ACC內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)平均增加14.98個(表3)。幼鼠ACC內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)受到新生期是否給予MS以及幼年期是否接受CRD刺激的影響;新生期給予MS和幼年期接受CRD刺激,均導(dǎo)致其ACC內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)明顯增多。新生期給予MS與幼年期接受CRD刺激,兩者之間無明顯交互作用(表4)。3傷害性刺激與fos蛋白表達(dá)的關(guān)系母嬰分離是人類早期生命應(yīng)激事件。國外報道,10%左右新生兒出生后需要進(jìn)入NICU進(jìn)行監(jiān)護(hù)治療,由此造成的產(chǎn)后新生期母嬰分離,嚴(yán)重影響孩子的身心健康;母體的存在,不僅僅為嬰兒提供了生存所必須的溫暖、營養(yǎng)和吮吸,還可以調(diào)節(jié)許多生理、行為和精神方面的發(fā)展過程。國內(nèi)外大多數(shù)研究認(rèn)為,新生期MS將對下丘腦-垂體-腎上腺素軸活動、內(nèi)臟高敏感性、腸道黏膜屏障功能異常、神經(jīng)系統(tǒng)的成熟及其他心理健康方面造成長期的影響。反復(fù)的新生期母嬰分離可能誘發(fā)兒童注意缺陷多動障礙綜合征、精神分裂癥,重度抑郁癥及創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等。許多研究表明,早期母嬰分離通過影響子代的神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)遞質(zhì)、谷氨酸、神經(jīng)營養(yǎng)因子及乙酰膽堿能系統(tǒng),對子代的心理、行為和認(rèn)知發(fā)育可產(chǎn)生不利影響,可增強(qiáng)其成年后對內(nèi)臟傷害性刺激的神經(jīng)反應(yīng),從而促進(jìn)身體及心理障礙疾病的發(fā)生、發(fā)展。母嬰分離這種早期負(fù)性事件,可引起中樞神經(jīng)長期改變,提示母嬰分離可能致敏了腦-腸軸上的神經(jīng)化學(xué)通路。已證實(shí):在外周神經(jīng)末梢、脊髓及大腦皮質(zhì)等多個水平發(fā)生的病理生理改變均可以影響、調(diào)節(jié)內(nèi)臟痛感覺的產(chǎn)生;內(nèi)臟感覺通路上的許多神經(jīng)遞質(zhì),包括C-FOS和降鈣素基因相關(guān)肽等在不同神經(jīng)控制水平發(fā)揮重要作用;人類C-FOS基因為即早基因,在包括神經(jīng)元在內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)胞中均有低水平表達(dá),受到刺激時,C-FOS就被激活,其產(chǎn)物FOS蛋白在細(xì)胞對外界刺激-轉(zhuǎn)錄耦聯(lián)的信息傳遞過程中起著核內(nèi)“第三信使”的重要作用。研究表明,傷害性刺激可引起C-FOS在與痛覺傳遞有關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)表達(dá),而且,慢性應(yīng)激較急性應(yīng)激可導(dǎo)致更為廣泛而持久的C-FOS表達(dá),FOS蛋白在機(jī)體受到外界傷害性刺激后,主要表達(dá)在與痛覺傳遞有關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi),所以可作為傷害性感受神經(jīng)元的興奮標(biāo)志物。下丘腦PVN、ACC及中縫核等腦區(qū)是幼鼠大腦中樞內(nèi)臟傷害性刺激信號傳導(dǎo)處理過程和感(知)覺的重要區(qū)域,是腦-腸軸的高級中樞,其激活和致敏在新生期MS誘導(dǎo)的內(nèi)臟痛高敏性中起到至關(guān)重要作用。已證實(shí):FOS蛋白可出現(xiàn)在上述如下丘腦PVN、ACC及中縫核等多個與痛覺密切相關(guān)的腦區(qū)。PVN屬“下丘腦促垂體區(qū)”,與腦干、邊緣系統(tǒng)、脊髓及垂體等均有密切的聯(lián)系,在下丘腦對內(nèi)臟活動的調(diào)節(jié)中占有重要地位。PVN的小細(xì)胞神經(jīng)元發(fā)出的軸突多終止于下丘腦基底部的正中隆起,與初級毛細(xì)血管網(wǎng)密切接觸,其分泌物可直接釋放到垂體門靜脈血管的血液中。ACC是邊緣系統(tǒng)的一部分,屬于內(nèi)側(cè)痛覺系統(tǒng),接受丘腦中線核和板內(nèi)核的纖維投射,板內(nèi)核傳遞的傷害性信號來自脊髓背角的傷害感受神經(jīng)元,ACC主要參與痛情緒的編碼。此外,除內(nèi)側(cè)和外側(cè)痛覺系統(tǒng)外,兩者間還存在皮質(zhì)-邊緣系統(tǒng)通路,該通路終止于邊緣系統(tǒng),與內(nèi)側(cè)痛覺系統(tǒng)在ACC匯集,因此,ACC在痛覺的形成中處于樞紐的位置,痛感覺和情緒在此整合而形成完整的痛覺體驗?；赑VN和ACC在內(nèi)臟痛覺形成中的重要作用,故腸道傷害性刺激后相關(guān)部位FOS蛋白表達(dá)必然升高。本研究通過對PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白表達(dá)的檢測,以探討中樞FOS蛋白表達(dá)與母嬰分離的關(guān)系,探索母嬰分離對大鼠成年后行為影響可能的機(jī)制,并為臨床疾病的預(yù)防、癥狀的改善和治療提供有價值的新途徑。母嬰分離使幼鼠對應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈,在此基礎(chǔ)上予以應(yīng)激刺激可使中樞神經(jīng)元活性明顯增加,不同腦區(qū)FOS蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng),說明母嬰分離對誘導(dǎo)中樞不同腦區(qū)內(nèi)FOS蛋白表達(dá)有活化作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)C-FOS的異常表達(dá)可能參與大鼠內(nèi)臟敏感性異常的調(diào)節(jié)。在本研究中,給予MS的A1B2組幼鼠大腦的PVN和ACC內(nèi)FLI細(xì)胞均較未給予MS的A2B2組有較明顯增加;而給予MS的A1B1組與未給予MS的A2B1組相比,同樣在6周齡時接受CRD,在PVN和ACC內(nèi)均出現(xiàn)大量FLI神經(jīng)元,FOS蛋白呈過度表達(dá)狀態(tài)。結(jié)果顯示,正常幼鼠PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)水平很低;新生期給予MS和幼鼠6周齡時接受CRD均分別造成幼鼠PVN和ACC內(nèi)FLI細(xì)胞數(shù)明顯增加;與新生期未給予MS的幼鼠相比,新生期給予MS后,在6周齡時受到CRD刺激可引起該組幼鼠更為明顯的FOS蛋白表達(dá)。新生期給予MS與幼年期接受CRD刺激,兩者之間無明顯交互作用。此研究結(jié)果表明幼鼠在正常生活狀態(tài)下,PVN和ACC內(nèi)存在著不同程度的FOS蛋白基礎(chǔ)低表達(dá),當(dāng)給予MS后,可引起幼鼠的內(nèi)臟高敏感狀態(tài),PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白表達(dá)增加;在此基礎(chǔ)上接受CRD刺激,則出現(xiàn)PVN和ACC內(nèi)FOS蛋白異常高表達(dá)和釋放。這