替米沙坦對(duì)sz誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌線粒體膜電位變化及細(xì)胞凋亡的影響

替米沙坦對(duì)sz誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌線粒體膜電位變化及細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)最近的研究，糖尿病及其并發(fā)癥均有明顯的裂紋膜滲透性改變。Waczulikova等也報(bào)道了糖尿病心肌病大鼠的心肌線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP)開(kāi)放增多。糖尿病時(shí)線粒體活性氧(ROS)產(chǎn)生增多、Ca2+超負(fù)荷等均可導(dǎo)致MPTP的開(kāi)放。線粒體膜電位(ΔΨm)下降是細(xì)胞凋亡的特異性改變,也是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)關(guān)鍵性變化。替米沙坦已廣泛應(yīng)用于原發(fā)性高血壓的治療,近年研究顯示其對(duì)糖尿病心肌亦起保護(hù)作用,但研究?jī)H局限于改善心肌纖維化及糖脂代謝紊亂等方面。本研究旨在通過(guò)觀察替米沙坦對(duì)糖尿病心肌ΔΨm變化的影響,探討其對(duì)糖尿病心肌細(xì)胞凋亡的作用,以及線粒體膜電位在此過(guò)程中的變化情況。1材料和方法1.1試劑與儀器鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,S0130,美國(guó)Sigma),替米沙坦(蘇州東瑞醫(yī)藥公司惠贈(zèng)),ΔΨm試劑盒(JC-1法,美國(guó)Invitrogen),線粒體活性氧試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥公司),低溫高速離心機(jī)(TGL-16M,湖南湘儀),F-7000型熒光分光光度計(jì)(日本HITACHI),光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)。1.2模型建立及分組健康成年雄性Wistar大鼠,SPF級(jí),體重400±20g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCXK-(軍)2007-004。大鼠一次性腹腔注射50mg/kgSTZ,以72h、7d后隨機(jī)血糖濃度≥16.7mmol/L作為1型糖尿病模型建模成功的標(biāo)準(zhǔn)。16只成模大鼠隨機(jī)分為糖尿病(DM)組和替米沙坦(T)組,每組8只;另選取8只健康大鼠作為正常對(duì)照(Con)組,予腹腔注射等體積的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。T組于每天上午給予替米沙坦8.34mg/(kg·d)灌胃,并測(cè)量體重以調(diào)節(jié)給藥劑量;DM組及Con組均予等體積生理鹽水灌胃。各組大鼠繼續(xù)原條件喂養(yǎng)12周后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。1.3隨機(jī)糖和體重測(cè)定采用血糖儀測(cè)定STZ注射后7d和12周時(shí)大鼠血糖水平;普通天平測(cè)定各組大鼠12周時(shí)終末體重。1.4差速離心法分離染色體懸液參考文獻(xiàn)的步驟進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),將大鼠斷頭處死,迅速開(kāi)胸取出心臟,剪取左心室前壁心室肌50～200mg,置于預(yù)冷的分離介質(zhì)(0.23mol/L甘露醇,0.07mol/L蔗糖,1mmol/LEDTA,10mmol/LTris-HCl,pH7.4)中,洗去血液,充分剪碎、勻漿(以9ml/g比例進(jìn)行),采用差速離心法分離線粒體:即以1000×g離心10min,棄沉淀;上清經(jīng)10000×g離心10min,棄上清;用分離介質(zhì)懸浮沉淀,再次以10000×g離心10min,其沉淀以分離介質(zhì)懸浮即制成線粒體懸液,以上操作均在0～4℃進(jìn)行。線粒體蛋白定量采用Bradford法,線粒體用量根據(jù)其蛋白含量決定。1.5dcfh-da反應(yīng)取大鼠心肌線粒體懸液150μl(含線粒體蛋白50μg),按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,加入琥珀酸鈉3.3mmol/L,然后加入終濃度為5μmol/L的DCFH-DA,反應(yīng)總體系為3ml,避光水浴15min后,立即于熒光分光光度計(jì)下測(cè)定900s(激發(fā)波長(zhǎng)488nm,發(fā)射波長(zhǎng)525nm),測(cè)試過(guò)程保持37℃恒溫。線粒體ROS產(chǎn)生速率以線粒體樣本熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸直線斜率減去本底熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸直線斜率表示,以fluorescenceunits/(s·mgpro)表示,簡(jiǎn)寫(xiě)為U/(s·mg)。1.6限制差質(zhì)體懸液體系采用JC-1法檢測(cè),參照文獻(xiàn)略加改進(jìn)。用膜電位反應(yīng)緩沖液(0.21mol/L甘露醇,0.07mol/L蔗糖,5mmol/LHEPES,pH7.4)懸浮分離好的線粒體懸液(含線粒體蛋白50μg),緩沖體系為2ml,各組分別設(shè)陰性對(duì)照。加入1μl解偶聯(lián)劑羰基氰化物間氯苯腙(carboxylcyanidemchlorophenylhydrazone,CCCP)30℃孵育10min,隨后加入0.2mmol/LJC-1染色液3μl,室溫避光10min,熒光分光光度計(jì)檢測(cè)其熒光強(qiáng)度[激發(fā)波長(zhǎng)488nm下的熒光強(qiáng)度-發(fā)射波長(zhǎng)590nm下的熒光強(qiáng)度,結(jié)果以相對(duì)熒光單位(RFU)表示。1.7心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)石蠟包埋切片,采用TUNEL法按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,光鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目,并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)。每組隨機(jī)抽取6張切片,400倍高倍鏡下應(yīng)用BIOMIAS圖像分析系統(tǒng)攝像,每張切片連續(xù)攝取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野中凋亡心肌細(xì)胞核數(shù)目,并計(jì)算其與心肌細(xì)胞核總數(shù)比值的平均值,作為AI。1.8統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠體重、比,總體重含量給予STZ注射7d后,DM組、T組大鼠間血糖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但均顯著高于Con組(P<0.01);DM組、T組大鼠體重顯著低于Con組(P<0.01),但與DM組比較,T組體重降低更明顯(P<0.05)。12周時(shí),DM組與T組大鼠血糖、體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表1)。2.2心肌m的變化與Con組比較,DM組、T組ROS水平均顯著升高(P<0.01),而T組顯著低于DM組(P<0.01)。與Con組比較,DM組、T組心肌ΔΨm均顯著下降(P<0.01),但T組與DM組比較顯著回升(P<0.01)。與Con組比較,DM組心肌細(xì)胞AI顯著升高(P<0.05),T組無(wú)明顯變化(P>0.05),但與DM組比較,T組心肌細(xì)胞AI顯著降低(P<0.05,表2)。3替米沙坦在大鼠心肌組織病理學(xué)改變時(shí)表1,本研究結(jié)果顯示,12周時(shí),光鏡下可見(jiàn)DM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡增多,與以往研究相符,且心肌ΔΨm下降明顯,線粒體ROS產(chǎn)生速率顯著增加。ΔΨm可以反映MPTP的開(kāi)放程度以及線粒體膜的損傷程度,ΔΨm下降是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性改變。有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病心肌病變時(shí),Ca2+內(nèi)流增加,肌漿內(nèi)Ca2+超負(fù)荷,而Ca2+與MPTP內(nèi)側(cè)的2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后,可使其構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致MPTP高水平開(kāi)放;同時(shí)糖尿病狀態(tài)下心肌線粒體ROS生成增多,而ROS標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位高,氧化能力強(qiáng),它通過(guò)耗竭還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)或NADPH,使電化學(xué)梯度顯著降低,從而誘發(fā)MPTP的異常開(kāi)放。MPTP異常開(kāi)放時(shí)直徑明顯增大,達(dá)到1.8～2.6μm,且呈持續(xù)狀態(tài),從而造成線粒體內(nèi)相對(duì)分子質(zhì)量小于1.5kD的物質(zhì)(如基質(zhì)內(nèi)的離子、溶質(zhì)小分子及某些蛋白質(zhì))通過(guò)MPTP釋放入胞質(zhì),內(nèi)膜兩側(cè)離子梯度消失,線粒體膜去極化,最后使膜電位降低。同時(shí)線粒體還釋放細(xì)胞色素C(cytrochomeC,Cyt-c),一旦進(jìn)入胞質(zhì),可在ATP或dATP的協(xié)同作用下與凋亡蛋白酶活化因子1(apoptosisprotease-activatingfactor-1,Apaf-1)結(jié)合并使其分子結(jié)構(gòu)改變從而激活caspase-9,活化的caspase-9又可激活其下游的caspase-3等酶系,引發(fā)caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。糖尿病狀態(tài)下,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rein-angiotensinsystem,RAS)系統(tǒng)被激活,血漿及心肌局部的AngⅡ合成增加,而有研究觀察到AngⅡ介導(dǎo)的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。替米沙坦是一種特異性的AT1受體拮抗劑,近年來(lái)在糖尿病心肌保護(hù)方面的報(bào)道頗多,主要認(rèn)為其可抑制AngⅡ與AT1受體結(jié)合,改善糖尿病心肌纖維化,另外,還可選擇性地激動(dòng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ),改善糖脂代謝,從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示,替米沙坦組大鼠ΔΨm較DM組有所回升,ROS產(chǎn)生速率有所下降,心肌細(xì)胞凋亡亦有顯著減少。同時(shí),本文作者觀察到替米沙坦可降低糖尿病大鼠機(jī)體的氧化應(yīng)激水平,提示其還可能通過(guò)降低糖