妊娠高血壓大鼠腦室旁核、視上核及孤束核的免疫熒光染色研究

妊娠高血壓大鼠腦室旁核、視上核及孤束核的免疫熒光染色研究

妊娠高血壓綜合征（pih，妊娠高血壓綜合征）是妊娠高血壓綜合征的主要原因之一。目前，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚。隨著人類基因組計(jì)劃研究的深入,目前較多學(xué)者認(rèn)為,妊高征有家族遺傳傾向,是一種多基因遺傳病。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensinsystem,RAS)一直為妊高征病因?qū)W研究的重點(diǎn)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RAS中諸多的基因可能參與了妊高征的發(fā)生發(fā)展。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中最重要的成分,是已知內(nèi)源性升壓物質(zhì)中作用最強(qiáng)的激素之一,AngⅡ受體是RAS的效應(yīng)器,AngⅡ大部分生物學(xué)效應(yīng)是通過AngⅡ1型受體(AT1)介導(dǎo)的,AT1是RAS作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。PIH發(fā)病過程中周圍臟器(血管、心臟、腎臟)的損傷是顯而易見的,然而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變化,尤其是心血管中樞的改變卻未見報道。本實(shí)驗(yàn)探討在PIH病理生理過程中母體腦內(nèi)的心血管調(diào)節(jié)核團(tuán)孤束核(NTS)、下丘腦室旁核(PVN)、視上核(SON)內(nèi)AT1含量的變化,為進(jìn)一步研究中樞對心血管活動的調(diào)節(jié)機(jī)制,以及RAS在妊娠高血壓的發(fā)病過程中的作用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1模型分組與血壓測量用亞硝基左旋精氨酸甲酯(L-NAME)阻斷一氧化氮(NO)合成可使孕鼠產(chǎn)生PIH特征及相應(yīng)的病理生理改變,本研究采用此方法制備PIH動物模型。10周齡SD雌性大鼠12只(180±10)g,南京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供,在相同環(huán)境下用正常飼料喂養(yǎng)。按雌雄2∶1合籠,次日根據(jù)陰道涂片鏡檢,以發(fā)現(xiàn)精子作為妊娠第1天。受孕后隨機(jī)分為2組,每組6只。(1)模型組:從孕13d至分娩每日皮下注射L-NAME250mg/kg;(2)對照組:正常妊娠組,從孕13d至分娩每日皮下注射生理鹽水。血壓測量:室溫20℃,2組大鼠在清醒狀態(tài)下,于每日上午9時用尾筒法測定尾動脈收縮壓和舒張壓,直至分娩。計(jì)算平均動脈壓,取其平均值(舒張壓+1/3脈壓)。尿蛋白測定:分別于妊娠第12-20天用標(biāo)準(zhǔn)代謝籠收集孕鼠24h尿量,以考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法測定尿蛋白濃度。仔鼠測量:剖宮取仔,記錄胎鼠數(shù),測胎鼠體重。1.2制作和切割于妊娠21d巴比妥鈉麻醉下,常規(guī)灌注、取材將含PVN、SON、NTS的組織塊在冰凍切片機(jī)中作連續(xù)冠狀切片(厚30μm)。1.3igma和igg生長切片經(jīng)5%BSA室溫封閉20min后,加兔抗AT1IgG(1∶200,美國Sigma公司)37℃孵育2h,然后4℃孵育24h,PBS充分洗滌;加FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100,南通碧云天公司)37℃孵育60min,PBS充分洗滌;甘油封片,熒光顯微鏡(德國Leica公司DFC300熒光顯微鏡)下觀察并拍照。1.4細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光切片采用LeicaLAS圖像分析系統(tǒng)(德國Leica公司)分析。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:在共調(diào)解時,單位面積計(jì)算模型化后,顯著性檢驗(yàn)為1.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn),顯著性水平設(shè)為α=0.05。2結(jié)果2.1l-ng勞動pih組和正常組孕鼠尿蛋白水平比較PIH組平均動脈壓為(135.0±4.5)mmHg,對照組平均動脈壓為(99.5±3.0)mmHg。經(jīng)t檢驗(yàn),P<0.05,可見PIH組血壓明顯高于正常對照組。皮下注射L-NAME后,給藥組孕鼠尿蛋白濃度顯著增加[(381.26±50.29)mg/Lvs(632.75±62.15)mg/L,P<0.05];胎鼠體重降低[(3.92±0.56)vs(3.25±0.41),P<0.05)]。2.2室旁核和亞核pvo參照Armstrong對大鼠PVN各亞核的劃分標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合Paxinos和Watson大鼠腦立體圖譜,將PVN分為4個大細(xì)胞亞核:前連合核(AC)、內(nèi)側(cè)室旁核(PVM)、外側(cè)室旁核(PVL)和室旁核后亞核(PvPO)。熒光顯微鏡下可見,兩組大鼠PVN內(nèi)AT1免疫陽性神經(jīng)元呈楔形集中分布于PVN的PVM和PVL,尤其在PIH組PVL尾側(cè)部AT1細(xì)胞數(shù)量較多,密集分布在PVL的背外側(cè)(圖1)。至PvPO水平AT1細(xì)胞數(shù)量減少,細(xì)胞散在分布于PVL背外側(cè)部。AT1免疫陽性神經(jīng)元胞體發(fā)出綠色熒光,細(xì)胞表面有綠色的反應(yīng)顆粒分布,胞體主要為圓形、卵圓形或梭形。PIH組陽性細(xì)胞數(shù)較對照組多(105.67±30.35vs78.46±27.03,P<0.01)。2.3大鼠son的表達(dá)SON細(xì)胞群密集分布于大腦底部視交叉(OC)上方的兩側(cè)。核團(tuán)呈三角形,頂尖向內(nèi)側(cè)傾斜。鏡下PIH組和對照組大鼠的SON可見AT1陽性細(xì)胞群。SON主部AT1陽性神經(jīng)元分布較為密集,呈內(nèi)側(cè)稍寬的帶狀分布于OC的外上方(圖2)。SON內(nèi)的AT1免疫陽性神經(jīng)元以大細(xì)胞型為主,神經(jīng)元胞體大,兩組大鼠SON內(nèi)AT1陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(79.13±20.30vs68.71±21.03,P>0.05)。2.4神經(jīng)元的分布AT1陽性神經(jīng)元在兩組大鼠NTS內(nèi)均有分布,而在PIH組呈現(xiàn)明顯的亞核分布特異性。在最后區(qū)(AP)平面,陽性神經(jīng)元主要位于NTS的背內(nèi)側(cè)、內(nèi)側(cè)和背外側(cè)亞核;在閂平面,陽性神經(jīng)元主要位于NTS的聯(lián)合亞核;在NTS的腹外側(cè)亞核也可見部分陽性神經(jīng)元分布(圖3)。AT1免疫陽性神經(jīng)元表面有綠色的反應(yīng)顆粒分布,胞體主要為圓形或卵圓形。PIH組NTS內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)較對照組多(91.04±34.46vs64.29±31.36,P<0.01)。3妊娠高血壓大鼠外周血at1的表達(dá)變化本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Yallampalli等的制模方法,L-NAME抑制NO合成后,孕鼠血壓明顯升高,尿蛋白顯著增加,胎鼠體重降低,胎鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩等一系列變化,與人類妊高征的癥狀及病理生理變化相似,說明妊高征動物模型是成功的,與文獻(xiàn)報道一致。胡玉紅等研究表明在妊高征時1166A→C變異體(AC、CC)和C等位基因的頻率明顯高于正常妊娠,認(rèn)為AT1基因A1166C多態(tài)性與妊高征有關(guān)。Wallukat等從妊高征患者血清中提取的免疫球蛋白可激活A(yù)T1,加快新生鼠心肌細(xì)胞的跳動,分娩后這種作用逐漸減弱,而正常妊娠婦女則無此作用,并證實(shí)這種免疫球蛋白為IgG,其作用于AT1的第2個細(xì)胞外環(huán),由PKC介導(dǎo)。認(rèn)為妊高征患者體內(nèi)存在AT1的興奮性自身抗體。這些研究都表明在妊娠高血壓的病理過程中,患者外周AT1表達(dá)是異常的。在中樞,有文獻(xiàn)報道正常大鼠下丘腦PVN、NTS和終板是AT1分布最密集的區(qū)域,內(nèi)源性的AngⅡ可能主要在NTS釋放,腦內(nèi)AngⅡ的作用主要由AT1介導(dǎo)的。對妊娠高血壓狀態(tài)下,腦內(nèi)AT1的分布尚缺乏報道。作者在對PIH大鼠的腦內(nèi)心血管核團(tuán)PVN、SON和NTS的研究中發(fā)現(xiàn):PIH大鼠與對照組大鼠一樣,在PVN、SON和NTS都有AT1陽性細(xì)胞;在PVN和NTS,PIH大鼠陽性細(xì)胞數(shù)較對照組多。提示中樞AT1的異常增加可能與妊娠高血壓的發(fā)病有關(guān)。NTS是最基本的血管中樞和心血管傳入神經(jīng)中繼站,接受由頸動脈竇、主動脈弓和心臟感受器經(jīng)舌咽神經(jīng)和迷走神經(jīng)傳入的信息,然后發(fā)出纖維至延髓和中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他部位如藍(lán)斑和下丘腦的神經(jīng)元。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作如下推測:由于心血管的傳入信息