產(chǎn)超廣esbls與非產(chǎn)esbls大腸埃希菌耐藥性及耐藥基因攜帶情況分析

產(chǎn)超廣esbls與非產(chǎn)esbls大腸埃希菌耐藥性及耐藥基因攜帶情況分析

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，大腿艾滋病毒的耐藥性（eco）逐年增加，對(duì)各種抗菌藥物的抗藥性需藥率高出臨床探討。ECO的耐藥機(jī)制很多,如細(xì)菌產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶對(duì)抗菌藥物的滅活與修飾;抗菌藥物作用靶位的改變;膜對(duì)抗菌藥物的通透性下降,藥物攝入減少;膜對(duì)抗菌藥物的主動(dòng)外排,藥物排出增加;細(xì)菌形成生物被膜;其中以產(chǎn)酶最為重要,研究的也最多。筆者主要針對(duì)ECO對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥性及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥基因攜帶情況進(jìn)行研究。1材料和方法1.1esblus陽(yáng)性菌株54株不重復(fù)ECO來(lái)自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院各種臨床標(biāo)本中分離的菌株;其中27株ESBLs陽(yáng)性菌,27株ESBLs陰性菌;所有菌株經(jīng)ATBExpression系統(tǒng)鑒定。大腸埃希菌ATCC25922敏感質(zhì)控菌株(山東省臨檢中心提供);肺炎克雷伯菌ATCC700603ESBLs陽(yáng)性質(zhì)控菌株(北京醫(yī)院惠贈(zèng))。1.2抗菌藥物的耐藥率、中介率、敏感率采用K-B法,按2005年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所/美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI/NCCLS)頒布的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算ECO對(duì)抗菌藥物的耐藥率、中介率、敏感率;抗菌藥物紙片均為英國(guó)Oxoid產(chǎn)品。1.3esbls陽(yáng)性試驗(yàn)按CLSI/NCCLS推薦方法,頭孢他啶與頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟與頭孢噻肟/克拉維酸,兩組任意一組后者與前者抑菌環(huán)直徑之差≥5mm,即確認(rèn)為ESBLs陽(yáng)性。1.4離心吸棄液挑取菌落置入內(nèi)含100μl生理鹽水的0.5ml離心管內(nèi),12000r/min離心5min,吸棄上清液;加裂解液A50μl、裂解液B2μl,混勻后置入55℃保溫1h,后置入95℃保溫5min,10000r/min離心30s,上清液即為擴(kuò)增的模板液。1.5pcr擴(kuò)增產(chǎn)物均為聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法。各種靶基因PCR擴(kuò)增體系均為:每反應(yīng)體系P1、P2引物各0.5μmol/L,dNTPs各200mmol/L,KCl10mmol/L,(NH4)2SO48mmol/L,MgCl22mmol/L,Tris-HCl(pH9.0)10mmol/L,NP400.5%,BSA0.02%(w/v),TaqDNApol1U,總反應(yīng)體積20μl(其中模板液5μl)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物>500bp熱循環(huán)參數(shù)均為:93℃預(yù)變性2min,然后按93℃60s、55℃60s、72℃60s共35個(gè)循環(huán),最后72℃延長(zhǎng)至2min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物<500bp熱循環(huán)參數(shù)均為:93℃預(yù)變性2min,然后按93℃30s、55℃30s、72℃60s共35個(gè)循環(huán),最后72℃延長(zhǎng)至2min,產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。引物序列見(jiàn)表1。1.6統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)ESBLs組與非產(chǎn)ESBLs組ECO耐藥情況,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件SPSS11.5,經(jīng)χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2eco耐藥基因攜帶情況2.1耐藥率54株ECO對(duì)22種抗菌藥物的藥敏率,見(jiàn)表2。2.2產(chǎn)ESBLs與非產(chǎn)ESBLsECO耐藥株在27株產(chǎn)ESBLs菌株中,頭孢噻肟不敏感株為26株,頭孢他啶不敏感8株,僅有1株頭孢噻肟敏感但頭孢他啶耐藥,頭孢他啶不敏感僅9株。對(duì)產(chǎn)酶組與非產(chǎn)酶組耐藥性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),ECO對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物與呋喃妥因耐藥性產(chǎn)酶組略高于非產(chǎn)酶組,但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.3ECOESBLs耐藥基因攜帶情況PCR檢測(cè)顯示,TEM型ESBLs型別最為常見(jiàn),16株擴(kuò)增陽(yáng)性占59.3%,CTX-M-1型9株占33.3%,SHV型5株占18.5%,OXA-1型8株占29.6%,6株未擴(kuò)增出陽(yáng)性結(jié)果,10株同時(shí)攜帶≥2種基因型。2.4ECO對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥基因的攜帶本試驗(yàn)用阿米卡星、奈替米星、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素來(lái)檢測(cè)ECO對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物耐藥情況,只要對(duì)其中任意1種抗菌藥物不敏感,即檢測(cè)其耐藥基因。檢測(cè)結(jié)果顯示,54株ECO中耐氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物44株,耐藥率為81.5%;PCR結(jié)果顯示,其中aac(3)-Ⅰ4株占9.0%;aac(3)-Ⅱ38株占86.4%;aac(6′)-Ⅰ17株占38.6%;aac(6′)-Ⅱ11株占25.0%;ant(2″)-Ⅰ8株占18.2%;ant(3″)-Ⅰ12株占27.3%。2.5ECO對(duì)喹諾酮類(lèi)抗菌藥物耐藥基因攜帶結(jié)果藥敏結(jié)果顯示,4種抗菌藥物有交叉耐藥性,54株病原菌中耐喹諾酮類(lèi)抗菌藥物為41株,耐藥率為75.9%,qnr基因檢出率為7.3%。ECO部分耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果,見(jiàn)圖1～4。3產(chǎn)酶基因型的檢測(cè)結(jié)果本試驗(yàn)的54株ECO對(duì)阿米卡星、奈替米星、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢西丁、氨曲南、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南和美羅培南具有較高的敏感性,敏感率達(dá)70.0%～100.0%;對(duì)喹諾酮類(lèi)、慶大霉素、哌拉西林的敏感性<27.8%。對(duì)ESBLs陽(yáng)性組與ESBLs陰性組進(jìn)行22種抗菌藥物耐藥性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),除兩組全部敏感的抗菌藥物外,ECO對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗菌藥物和呋喃妥因的耐藥性產(chǎn)酶組略高于非產(chǎn)酶組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而對(duì)其余13種抗菌藥物,產(chǎn)酶組耐藥性明顯高于非產(chǎn)酶組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;分析原因,一方面是與ESBLs的水解底物有關(guān);另一方面可能與攜帶編碼ESBLs基因的質(zhì)粒上往往同時(shí)攜帶其他類(lèi)抗菌藥物耐藥基因有關(guān)。本次PCR結(jié)果顯示,TEM型ESBLs型別最為常見(jiàn),16株擴(kuò)增陽(yáng)性;但這種酶是廣譜酶還是超廣譜酶還需測(cè)序證實(shí)。國(guó)內(nèi)在ECO中檢測(cè)到TEM型ESBLs的報(bào)道少見(jiàn),李家斌等在3株ECO和1株克雷伯菌屬中檢測(cè)到TEM-10型ESBLs為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道;陳炫等在2株ECO中檢測(cè)到TEM-19型ESBLs,此型主要見(jiàn)于美國(guó)和法國(guó)。本次PCR結(jié)果,SHV型5株陽(yáng)性,熊自忠等和胡云建等分別在2株和1株ECO中檢測(cè)到SHV-12型ESBLs;提示SHV型ESBLs并不是我國(guó)ECO主要的ESBLs型別。本次試驗(yàn)檢測(cè)到9株CTX-M-1陽(yáng)性菌株,但就我國(guó)各大醫(yī)院的相關(guān)試驗(yàn)結(jié)果及我國(guó)該基因型的流行趨勢(shì),我們并不排除本次試驗(yàn)所測(cè)的ESBLs陽(yáng)性菌株尚存在其他CTX-M型ESBLs,CTX-M型ESBLs為我國(guó)ESBLs的主要酶型,可能與廣泛使用頭孢噻肟有關(guān)。OXA型ESBLs以往國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道主要存在于銅綠假單胞菌和鮑氏不動(dòng)桿菌中,而在腸桿菌科細(xì)菌中所占比例較少,國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道也較少;本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),8株OXA-1型擴(kuò)增陽(yáng)性,比例較高。氨基糖苷類(lèi)修飾酶按功能可分成乙酰轉(zhuǎn)移酶(AAC)、磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)、核苷轉(zhuǎn)移酶(ANT)3類(lèi),目前已發(fā)現(xiàn)的有>30種。本研究發(fā)現(xiàn)aac(3)-Ⅱ和aac(6′)-Ⅰ為我院臨床ECO主要的產(chǎn)酶基因,分別占86.4%和38.6%;而美國(guó)則以ant(2″)和aac(2)為主;捷克和斯洛伐克是ant(2″)和aac(3);希臘則以aac(6′)-Ⅰ檢出率最高。aac(3)主要修飾慶大霉素、妥布霉素,但aac(3)-Ⅰ不是我院ECO主要的基因型,僅檢測(cè)到4株。本次試驗(yàn)凡擴(kuò)增出aac(3)-Ⅱ基因的菌株,其表型均表現(xiàn)為慶大霉素耐藥,但aac(3)-Ⅱ基因擴(kuò)增陽(yáng)性的菌株并不是都對(duì)妥布霉素、奈替米星、卡那霉素表現(xiàn)為耐藥,其原因可能與不同抗菌藥物被修飾的速度不同,使其產(chǎn)生耐藥情況不同,如妥布霉素被鈍化的速度僅為慶大霉素的1/4,故臨床產(chǎn)aac(3)鈍化酶的菌株對(duì)慶大耐藥,但對(duì)妥布霉素仍敏感。此酶對(duì)阿米卡星尚穩(wěn)定,因?yàn)閼c大霉素、妥布霉素、奈替米星都存在3-位氨基,而aac(3)為氨基糖苷-N-3-乙酰基轉(zhuǎn)移酶,ECO耐藥株通過(guò)aac(3)-Ⅱ基因編碼的aac(3)-Ⅱ?qū)ι鲜隹咕幬镞M(jìn)行鈍化介導(dǎo),但阿米卡星由于1-氨基被4-氨基-2-羥丁酰取代,對(duì)鄰近的3-位氨基造成空間上的位阻而形成aac(3)-Ⅱ鈍化酶的抗性。aac(6′)-Ⅰ為阿米卡星修飾酶,3株阿米卡星耐藥菌均檢測(cè)到aac(6′)-Ⅰ,但其他14株攜帶aac(6′)-Ⅰ基因表型均對(duì)阿米卡星敏感,這可能是由于病原菌攝取或轉(zhuǎn)運(yùn)抗菌藥物的速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)藥物被修飾的速度,使較多藥物進(jìn)入菌體與核糖體結(jié)合而發(fā)揮作用。本次試驗(yàn)顯示,ant(2″)-Ⅰ和ant(3″)-Ⅰ也占有一定的比例,分別為18.2%和27.3%。喹諾酮類(lèi)藥物是近20年來(lái)發(fā)展十分迅速的一類(lèi)抗菌藥物,因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、使用方便、劑型多等優(yōu)點(diǎn),在國(guó)內(nèi)外臨床控制感染性疾病中普遍應(yīng)用;同時(shí)細(xì)菌對(duì)該類(lèi)藥物的耐藥性也成蔓延趨勢(shì)。以前認(rèn)為病原菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗菌藥物的耐藥機(jī)制,主要通過(guò)靶位的改變(