腎纖復元膠囊對慢性腎功能衰竭大鼠血清生化指標及殘腎組織表達的影響

腎纖復元膠囊對慢性腎功能衰竭大鼠血清生化指標及殘腎組織表達的影響

腎衰竭是腎衰竭和慢性腎功能衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。在炎癥、免疫反應、毒素、缺氧和其他刺激下，它會受損腎臟產(chǎn)生固有的細胞，并激活并產(chǎn)生各種促生素。側(cè)分泌和自分泌導致許多促生素因子，如細胞因子、生長因子、血管活性因子和沿海粘連因子。這些致纖維化因子進一步刺激腎臟固有細胞增殖及轉(zhuǎn)分化為表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的肌成纖維細胞。肌成纖維細胞具有很強的增殖能力,可合成Ⅰ型膠原等細胞基質(zhì)外(ECM)成分,導致ECM大量聚積,造成腎臟纖維化。結(jié)締組織生長因子(CTGF)作為介導TGF-β促纖維化活性的下游效應因子參與調(diào)控腎臟固有細胞增殖、轉(zhuǎn)分化以及ECM合成。因此對CTGF的調(diào)控是目前防治腎纖維化研究領(lǐng)域的熱點。1.1實驗儀器及動物1.1.1實驗藥物“腎纖復元膠囊”由我院康復科何成奇教授組方,其成分為:三七、大黃、丹參、黃芪等,為粉末裝膠囊。給藥前將“腎纖復元膠囊”制成湯劑。氯沙坦購自默沙東公司(商品名:科素亞)。1.1.2實驗試劑及主要儀器抗α-SMA單抗購自德國Dako公司;兔抗鼠Ⅰ型膠原抗體購自北京中山生物技術(shù)公司;RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司;Trizol試劑購美國Sigma公司。美國Spot圖像分析儀和GDS8000凝膠圖像分析系統(tǒng)。1.1.3實驗動物雄性Wistar大鼠140只,4～6周齡,體質(zhì)量(140±20)g。購自我校實驗動物中心。1.2腎功檢測及預測1.2.1模型制作用5/6腎切除方法建立慢性腎功能衰竭動物模型。第一次手術(shù)切除左腎2/3,一周后行第二次手術(shù)完全切除右腎。1.2.2動物分組和處理將大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=20)、模型組(n=40)、腎纖復元膠囊治療組(n=40)和氯沙坦治療組(n=40)。后3組大鼠接受慢性腎衰模型制作,假手術(shù)組僅在背部做一切口暴露腎臟后縫合,不切除腎臟。模型建立后,兩治療組分別灌胃給予“腎纖復元膠囊”(0.3mg/kg·d)和氯沙坦(150mg/kg·d)。模型組和假手術(shù)組每日予以相應量的生理鹽水灌胃。分別于模型建立后4周、8周、12周時以代謝籠采集尿樣測尿蛋白、清潔處死部分大鼠,采集腹主動脈血樣用Beckman全自動生化儀進行腎功檢測。對殘腎組織行病理切片α-SMA、Ⅰ型膠原免疫組化染色檢測,具體為:各組均在8周、12周選α-SMA、Ⅰ型膠原染色各5張切片,每張切片隨機選取200倍視野3個。每個視野經(jīng)Spot軟件標準化數(shù)據(jù)后,取其平均積分光密度值進行統(tǒng)計分析。1.2.3鼠腎總RNA提取分別取各組鼠殘腎組織100mg,加入1mLTrizol試劑,提取各組鼠腎總RNA(據(jù)試劑說明書),DU-640紫外分光光度計測260nm的吸光度值(A260),以A260計算RNA濃度。1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)根據(jù)文獻合成CTGF和β-actin寡核苷酸引物。CTGF上游5′-CTAAGACCTCTGGAATGGGC-3′,下游5′-CTCAAAGAAGTCATTGCCCCC-3′,擴增產(chǎn)物為383bp的CTGFcDNA片段;β-actin上游5′-AACCGGGAGAAGATGACCCAGATCATGTT-T-3′,下游5′-GTGAAGCTCGTTCTCTAC-CGGCGTAGTAGC-3′,擴增產(chǎn)物為352bp的β-actincDNA片段。1.2.5PCR產(chǎn)物的檢測與分析取5μLPCR產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳40min,紫外燈下成像,GDS8000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行灰度掃描,并以β-actin為內(nèi)參照,作校正相對量分析,數(shù)值以兩者之積分吸光度的比值表示。1.3統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間差異比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1血尿素氮、胱氨酸和24h尿蛋白定量的比較由表1可以看出,模型組各相應時間點的血尿素氮、肌酐和24h尿蛋白定量均明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)?！澳I纖復元膠囊”治療組和氯沙坦治療組各相應時間點的血尿素氮、肌酐和24h尿蛋白定量均低于相應時間點的模型組(P<0.05)。兩個治療組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2.2腎纖復元膠囊和氯沙坦治療組①假手術(shù)組:腎小球、腎小管、血管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,未見明顯病變。②模型組:部分腎小球萎縮消失;殘余腎小球偶有代償性肥大,多數(shù)結(jié)構(gòu)不清,主要表現(xiàn)為球囊變小。毛細血管透明變性,有的僅見內(nèi)皮細胞核。大量單核/巨噬細胞、淋巴細胞浸潤。間質(zhì)纖維化;8周即有明顯的α-SMA及Ⅰ型膠原的表達,并且隨時間延長而明顯加重。③腎纖復元膠囊和氯沙坦治療組:腎小球大部分存在,結(jié)構(gòu)欠清。腎小管上皮濁腫,有的嗜酸性變,胞核固縮;有的細胞脫落,在管腔內(nèi)形成細胞團。間質(zhì)纖維組織輕度增生;少量炎細胞浸潤。α-SMA及I型膠原染色較模型組為輕(P>0.05)。見圖1、圖2。由表2看出,“腎纖復元膠囊”治療組和氯沙坦治療組α-SMA積分光密度值、Ⅰ型膠原積分光密度值均低于相應時間點的模型組(P<0.01)。治療組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2.3ctgf蛋白表達由圖3和表3可看出,隨著時間的延長模型組CTGF表達逐漸增高,12周表達最高?！澳I纖復元膠囊”治療組和氯沙坦治療組CTGF表達均低于相應時間點的模型組(P<0.05)。治療組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3腎纖復元膠囊5/6腎切除是較為經(jīng)典的慢性腎衰模型。本研究中,大鼠在5/6腎切除術(shù)后4周開始,24h尿蛋白排泄明顯增加,腎功能惡化,殘腎病理改變?yōu)槟I小球代償性肥大、程度不等的硬化,腎小管萎縮和間質(zhì)炎性細胞浸潤,證明慢性腎衰竭模型建立成功。腎臟纖維化是各種腎臟疾病慢性進展,最后導致慢性腎功能衰竭的共同機制,因而及早阻止甚至逆轉(zhuǎn)腎纖維化,對防治終末期腎功能衰竭有重大意義。目前對腎臟纖維化治療方法不多,但已有研究證實,血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑有拮抗腎臟纖維化、延緩腎功能進展的作用。因此本研究以血管緊張素Ⅱ受體(ARB)拮抗劑氯沙坦作為陽性對照藥物,探討“腎纖復元膠囊”可能的抗腎纖維化作用機制。CTGF由Bradham等于1991年,在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中首次分離得到,其廣泛存在于人體組織器官中,其中腎臟含量最高。CTGF表達在正常腎組織臟層與壁層上皮細胞、間質(zhì)細胞、小管旁毛細血管內(nèi)皮細胞及間質(zhì)成纖維細胞。而在各種病因所致腎纖維化中,CTGF表達是增加的。Zhang等用5/6腎切除模型研究表明CTGF表達增高與細胞轉(zhuǎn)分化形態(tài)學改變(α-SMA表達陽性)相一致,認為CTGF可誘導腎小管上皮細胞表達α-SMA轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞。因此,調(diào)控CTGF的表達有助于防止腎纖維化,延緩慢性腎功衰的進展。慢性腎功能衰竭屬于中醫(yī)學“關(guān)格”、“癃閉”、“水腫”、“虛勞”等范疇,其起病緩慢,病史較長,因此病情遷延,較為復雜。其病變過程往往因邪實致虛,其中以肝、脾、腎虛為主,病情逐漸發(fā)展而加重,繼而在體虛的基礎(chǔ)上產(chǎn)生實邪,或因外邪侵襲,情志、飲食所傷,勞累過度而使病情加重,最后導致正氣虛衰、濁邪壅滯,出現(xiàn)虛實夾雜現(xiàn)象。其發(fā)病機制中以脾腎虛衰,濁毒潴留為關(guān)鍵,總的病機可概為本虛標實,正虛為本,邪實為標?！澳I纖復元膠囊”正是根據(jù)這一病理特點按照中醫(yī)辯證施治的理論將三七、黃芪、丹參、大黃等中藥按一定配方精心研制的復方制劑,具有益氣健脾除濕,軟堅活血化瘀的作用。現(xiàn)代藥理研究表明:大黃能有效地抑制腎細胞外基質(zhì)的增生和腎固有細胞的分裂增殖,減緩腎纖維化進程;丹參可以促進纖維蛋白的降解,抑制成纖維細胞生長并促進其凋亡;三七總皂甙可抑制IL-2誘導的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化及ECM分泌,防治腎纖維化。本研究表明慢性腎功衰殘腎組織CTGF表達增強,細胞轉(zhuǎn)分化形態(tài)學改變(α-SMA表達陽性)明顯,代表ECM合成的Ⅰ型膠原積聚增加。“腎纖復元膠囊”有類似于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦的作用,減少CTGF在殘腎組織表達,減輕殘腎組織細胞轉(zhuǎn)分化和抑制Ⅰ型膠原積聚的作用,從而達到抗腎臟纖維化,保護殘余腎功的作用。這為臨