電針及其預(yù)處理對cums大鼠海馬5-h、5-h表達的影響

電針及其預(yù)處理對cums大鼠海馬5-h、5-h表達的影響

抑郁具有“四病多快”的特點，如高發(fā)病率、高自殺、高復(fù)發(fā)、高殘疾、識別率、治療率和綜合控制率。與嚴重的公共衛(wèi)生問題和突出的社會問題相比，國際社會達成了共識。世界衛(wèi)生組織(WHO)將21世紀的第一年(2001年)定為“精神衛(wèi)生年”,21世紀也被稱為“抑郁癥的世紀”,預(yù)計到2020年,抑郁癥將會排到“全球疾病負擔”的第二位。長期研究證實,抑郁癥與5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)系統(tǒng)功能低下密切相關(guān)(經(jīng)典單胺假說),其紊亂將導致一系列不良情緒產(chǎn)生,如焦慮、抑郁、恐懼等。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(5-HTT)是5-HT能神經(jīng)末梢的一種膜蛋白,能和突觸間隙中5-HT結(jié)合,將其轉(zhuǎn)運至神經(jīng)元的軸突末端,因此決定了突觸后受體介導信號的強度和作用持續(xù)時間,成為反映5-HT能神經(jīng)元功能活動的重要指標,也是5-HT能神經(jīng)末梢多寡的間接反映,其表達變化直接影響5-HT參與的神經(jīng)活動。為此本研究擬通過孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激(chronicunpredictablemildstress,CUMS)復(fù)制抑郁癥模型并運用電針進行干預(yù),通過免疫組織化學法檢測大鼠海馬內(nèi)5-HT及5-HTT的表達情況,以探索5-HT、5-HTT在大鼠實驗性抑郁癥發(fā)病過程中的作用機制及電針干預(yù)對其的影響,為臨床抑郁癥的診斷和防治提供新的途徑及實驗室依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1[國家標準]scxk成年雄性SD大鼠60只,體質(zhì)量(200±10)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[合格證號:SCXK(京)2006-0009]。1.1.2實驗大鼠行為評分飼養(yǎng)條件如下:溫度(25±2)℃,濕度(50±20)%,自然光照,自由進食、進水(除實驗要求禁食禁水外)。實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,1周后采用開野試驗、糖水試驗及體重測量進行行為學評分,選取得分相近的SD大鼠60只,隨機分為5組,每組12只。空白組6只/籠飼養(yǎng),正常飲食,不給予任何刺激;模型組1只/籠孤養(yǎng)結(jié)合慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激。1.1.3羊抗兔免疫干擾試驗(1)試劑耗材:百憂解(美國禮來公司生產(chǎn),20mg×7,批號:J20030017);5-HT、5-HTT抗體試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白IgG及SP試劑盒(北京中山生物科技公司);DAB顯色試劑盒(北京中山生物科技公司);枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);PBS緩沖液(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)。(2)針具:華佗牌無菌針灸針,規(guī)格:0.30mm×25mm(天津杏林書院醫(yī)療器械有限公司);LH202型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京大學神經(jīng)科學研究所監(jiān)制,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司生產(chǎn));ZJ-12H音樂電針治療儀(中國針灸學會研制,哈爾濱致厚醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn))。1.2方法1.2.1單因素繁殖和cums模型的建立1.2.2“百會”針、“印堂”針空白組:不給予任何處理。模型組:每天給予慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng)。脈沖電針組:每天給予慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng),參照全國針灸學會實驗針灸研究會制定的“實驗動物針灸穴位圖譜”選取相當于人體解剖部位的“百會”穴和“印堂”穴進行針刺,針柄接韓氏電針儀,于每日進行應(yīng)激刺激前1h進行電針,平刺進針,“百會”針尖向后頭部,“印堂”針尖向鼻尖方向(兩針柄間放置消毒脫脂棉球隔離以避免短路),進針深度為0.5~1cm,電針頻率為2Hz,電流強度為1mA,每次20min,每天1次,共電針21天。電針預(yù)處理組:在實驗開始前10天進行和電針組同樣的針刺,但不予造模刺激,而是等到第11天開始,和所有需要造模的大鼠一起接受造模刺激,并繼續(xù)接受電針治療,共電針31天。百憂解組:每天給予慢性應(yīng)激刺激結(jié)合孤養(yǎng),將百憂解以生理鹽水配制成1mg/ml,按照2mg/kg灌胃給藥,每天1次,共21天。1.2.3內(nèi)側(cè)周壁及眼底分布敞箱長100cm×寬100cm×高50cm,內(nèi)側(cè)周壁及底面均為黑色,底面用白線劃分為面積相等的25塊。操作步驟參考本課題組前期研究結(jié)果,但將觀察時間由3min延長至5min。1.2.4抗抗體濃度5-ht、5-htt表達情況免疫組織化學法檢測大鼠海馬5-HT、5-HTT表達情況,具體操作步驟參考本課題組前期研究結(jié)果,一抗抗體濃度5-HT(1:50)、5-HTT(1:50)。1.2.5統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(ue0af±s)表示。用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0進行統(tǒng)計分析,多組間比較用單因素方差分析,兩組間比較用LSD檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義的標準。2結(jié)果2.1造模成功組和驗證如封三彩圖1所示,應(yīng)激刺激21天后模型組水平運動及垂直運動與空白組比較均明顯減少(P<0.01),說明造模成功。與模型組比較,百憂解組與兩個電針組活動度均明顯升高(P<0.01),說明百憂解和兩種電針均有抗抑郁作用,且兩組電針與百憂解組相比無統(tǒng)計學差異。2.2各組小鼠海馬內(nèi)5-ht表達比較如封三彩圖2所示,模型組大鼠海馬內(nèi)5-HT、5-HTT表達水平下降,與空白組比較有顯著性差異(P<0.01);脈沖電針組、電針預(yù)處理組及百憂解組與模型組比較,海馬內(nèi)5-HT表達上調(diào),且有統(tǒng)計學差異(P<0.01),而3組治療組之間無差異;脈沖電針組、百憂解組與模型組比較,海馬內(nèi)5-HTT表達上調(diào)(P<0.01),電針預(yù)處理組與模型組比較,有上調(diào)趨勢,但無統(tǒng)計學意義,脈沖電針組、百憂解組與電針預(yù)處理組比較,有顯著性差異(P<0.01),說明電針預(yù)處理上調(diào)5-HTT效果不及其余兩治療組。3促進5-ht神經(jīng)通信通量的改變本實驗采用孤養(yǎng)與CUMS結(jié)合的方法復(fù)制抑郁模型,具有應(yīng)激因子多變及不可預(yù)見的特點,與人類抑郁癥的發(fā)病機制比較相似。造模后模型組大鼠活動減少,探索興趣降低,說明抑郁模型復(fù)制成功,藥物組和電針組均能逆轉(zhuǎn)此變化,有抗抑郁的作用,可進行下一步機制分析。海馬與學習、記憶、行為及情緒密切相關(guān),是應(yīng)激損傷的重要靶點。五羥色胺(5-HT,serotonin)是動物體內(nèi)一種高度保守的化學物質(zhì),存在于大腦和消化道中,具有傳導神經(jīng)信號的功能,在各種調(diào)節(jié)過程中起著關(guān)鍵性的作用,如情感、動機、認知、喂食、睡眠及傷害性感受等等。5-HT在發(fā)揮生理功能后被滅活,以免產(chǎn)生中毒反應(yīng)及5-HT受體的脫敏,這個過程主要是依靠5-HT轉(zhuǎn)運體來完成的。五羥色胺轉(zhuǎn)運體(5-HTtransporter,5-HTT/serotonintransporter,SERT)是一種對5-HT有高度親和力的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,廣泛存在于大腦的邊緣系統(tǒng)、胃腸道的嗜鉻細胞膜、肥大細胞及5-HT能神經(jīng)突觸前膜上。它從神經(jīng)突觸間隙中重新攝取5-HT進入突觸前神經(jīng)元,可以直接影響突觸間隙5-HT的濃度,并能間接反映5-HT能神經(jīng)纖維末梢的數(shù)量。5-HTT從突觸間隙中移除5-HT而決定突觸后受體介導信號的量和作用的持續(xù)時間,進而在5-HT神經(jīng)傳遞的微調(diào)中起著關(guān)鍵的作用。中醫(yī)學認為抑郁癥發(fā)病的病機是臟氣受損、髓海虧虛、神機紊亂。印堂、百會為督脈之穴,督脈行于身后,循脊入腦,其布在身,其用在神,其本在腦,本著“經(jīng)脈所過,主治所及”,選取督脈治療與腦相關(guān)的神志病符合中醫(yī)治病必求其本之說。此外,印堂穴具有調(diào)神醒腦之功效,百會穴為督脈與手足三陽經(jīng)及足厥陰肝經(jīng)之會,選取印堂、百會來治療抑郁癥,可以調(diào)節(jié)其髓海機能,增進其“五臟化氣”的生理功能,使其紊亂的神機恢復(fù)正常,以達到抗抑郁的效果。電針療法是在我國傳統(tǒng)針灸治療基礎(chǔ)上發(fā)展而來,脈沖電針儀能發(fā)出周期性重復(fù)的波形,用以加強針感,具有針刺和電場的雙重作用。近10年來國內(nèi)外研究表明針灸預(yù)處理能啟動機體內(nèi)源性保護機制,調(diào)動各種自我反饋和調(diào)節(jié)機制以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,產(chǎn)生預(yù)防疾病的作用。趙宇輝通過研究發(fā)現(xiàn)針灸預(yù)處理可以延緩或者阻斷試驗性心肌缺血的發(fā)展進程,并且具有提高心肌組織在缺血時對一系列代謝紊亂的耐受能力,增加心肌細胞的存活率,改善預(yù)后的作用。有學者通過實驗發(fā)現(xiàn),針刺預(yù)處理與造模間隔時間長短不同對于神經(jīng)元的保護作用有很大差異,預(yù)處理后半小時再進行腦出血造模可使全腦缺血再灌注后變形死亡的神經(jīng)元減少25~30%。路志紅等在大鼠進行腦缺血造模前對百會穴進行針灸預(yù)處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)針灸預(yù)處理后的大鼠可明顯縮小腦缺血造模引起腦及神經(jīng)的損害程度,與肢體非穴相比,其誘導大鼠腦缺血耐受的作用具有明顯的差異。由于針刺預(yù)處理更為安全可行,因此更具有臨床研究與應(yīng)用價值。本實驗結(jié)果顯示,脈沖電針與電針預(yù)處理治療在改善抑郁模型大鼠行為學方面與經(jīng)典藥物百憂解(即氟西汀)療效一致,說明電針及其預(yù)處理療法效果不遜于經(jīng)典抗抑郁藥物;抑郁大鼠海馬內(nèi)5-HT、5-HTT表達減少,兩組電針及百憂解均能上調(diào)其表達,且無統(tǒng)計學差異,只是在上調(diào)5-HTT方面,電針及百憂解較電針預(yù)處理療效略勝一籌。5-HTT是許多抗抑郁藥