家族性高膽固醇血癥患者家系低密度脂蛋白受體基因的克隆與分析

家族性高膽固醇血癥患者家系低密度脂蛋白受體基因的克隆與分析

高脂肪家庭性祖母硬化（fh）是一種常染色體顯性遺傳疾病，是導(dǎo)致動脈硬化（as）和早期冠狀動脈粥樣硬化的重要危險因素。該病的病因是低密度脂質(zhì)炎（ldl-r）的突變，導(dǎo)致腺體功能異常。在英美等發(fā)達(dá)國家,55歲以下的冠心病患者中5%～10%為FH患者。研究LDL-R基因突變對探討LDL-R導(dǎo)致AS機(jī)制和防治冠心病具有重要意義。目前在FH患者中已發(fā)現(xiàn)900余種LDL-R基因突變和大量的單核苷酸多態(tài)性。國內(nèi)外在華人FH患者中已發(fā)現(xiàn)LDL-R基因51種突變,但以國外研究占多數(shù),國內(nèi)研究相對滯后。本文對1例臨床診斷為FH純合子的先證者及家系成員進(jìn)行臨床檢查;采用流式細(xì)胞儀檢測先證者及其父母外周血淋巴細(xì)胞LDL-R表達(dá)量和功能;并對LDL-R基因進(jìn)行PCR結(jié)合核苷酸序列分析,以發(fā)現(xiàn)我國LDL-R基因突變的新類型,探討其分子病理機(jī)制。1對象和方法1.1血漿置換后1年生fh北京安貞醫(yī)院AS門診收治1例男性患者,18歲,肘、膝、踝關(guān)節(jié)多部位皮膚黃色瘤及肌腱黃色瘤逐漸增大,雙眼可見角膜弓,在未服用降脂藥情況下,TC16mmol/L,血漿置換后1年仍未見下降。根據(jù)我國臨床診斷FH標(biāo)準(zhǔn):成人血清TC>7.8mmol/L;16歲以下兒童TC>6.7mmol/L;或成人LDL-C>4.4mmol/L,患者或親屬有腱黃色瘤者診斷為純合子FH,未達(dá)純合子標(biāo)準(zhǔn)者診斷為雜合FH。該患者診斷為FH純合子。知情同意后以該患者為先證者收集與其有血緣關(guān)系的親屬,共收集到51例,并根據(jù)FH診斷標(biāo)準(zhǔn):TC>6.19mmol/L診斷FH。1.2頸動脈內(nèi)壓監(jiān)測對先證者及其家系成員進(jìn)行常規(guī)體格檢查、病史采集,并采用氧化酶法測定血清中TC、LDL-C、TG含量,采用免疫沉淀法測定載脂蛋白AI(ApoAI)和載脂蛋白B100(ApoB100),ELISA法測定Lp(a),根據(jù)臨床FH診斷繪制家系圖確定遺傳方式。采用美國飛利浦公司生產(chǎn)的HP4500型、西門子公司Sequioa512彩色超聲診斷儀,探頭頻率為3～11MHz,取頸動脈長軸切面,在距分叉處約1cm范圍內(nèi)頸總動脈處停幀,測量先證者及其父母頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度(IMT),并采用同樣方法同時檢測其外周血管情況。超聲判斷標(biāo)準(zhǔn)為:IMT>0.10mm為內(nèi)膜增厚,IMT>0.12mm視為斑塊形成。采用美國ACUSON公司SequoiaC256型彩色多普勒顯像儀,常規(guī)檢測心臟和瓣膜的結(jié)構(gòu);采用注射泵對先證者靜脈注射腺苷(140μg·kg-1·min-1),應(yīng)用無創(chuàng)性經(jīng)胸多普勒結(jié)合二次諧波技術(shù),測量注射前后最大冠狀動脈擴(kuò)張狀態(tài)下的冠狀動脈血流與靜息狀態(tài)下冠脈血流的比值——冠狀動脈血流速度儲備(CFVR),以評價冠狀動脈的生理功能。1.3ladl-r和cd3抗體的流式細(xì)胞儀檢測根據(jù)我實(shí)驗(yàn)室已建立的流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞LDL-R表達(dá)量和功能的方法,以新鮮外周血經(jīng)溶血素處理后分別加入FITC標(biāo)記的抗人LDL-R的抗體和LDL,并加入PE標(biāo)記的CD3抗體,分別在4℃和37℃條件下孵育,流式細(xì)胞儀檢測各標(biāo)本的平均熒光強(qiáng)度,與正常人比較來評估其細(xì)胞表面LDL-R表達(dá)量和結(jié)合、內(nèi)化LDL的功能。1.4受影響基因及其突變的分析1.4.1糖凝膠電泳鑒定提取先證者基因組DNA,擴(kuò)增ApoB100基因3500區(qū)域的片斷309bp。瓊脂糖凝膠電泳鑒定:對鑒定后的PCR產(chǎn)物經(jīng)正反雙向核苷酸序列分析及與正常序列比對,排除由ApoB100基因3500附近位點(diǎn)突變導(dǎo)致的家族性ApoB100缺陷癥(familialdefectiveapolipoproteinB-100,FDB)。1.4.2核苷酸序列分析參照我實(shí)驗(yàn)室已建立的降落式PCR方法擴(kuò)增先證者LDL-R基因啟動子和全部18個外顯子,瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并送交北京三博測序公司進(jìn)行核苷酸序列分析,分析結(jié)果經(jīng)BLAST分析后,如發(fā)現(xiàn)錯義突變點(diǎn)將其父母的該片段同樣進(jìn)行核苷酸序列分析。2結(jié)果2.1家系及外周血管檢測結(jié)果先證者雙眼可見角膜弓,肘、膝、踝關(guān)節(jié)多部位皮膚黃色瘤及肌腱黃色瘤且逐漸增大(圖1),其他家系成員未見類似體征。先證者血清TC、LDL-C水平明顯增高,而TG水平正常范圍;其父母TC水平雖較先證者低,但也明顯高于正常值,分別為12.1mmol/L、9.5mmol/L,符合FH雜合子臨床診斷(表1)。家系成員中共有14人符合FH診斷標(biāo)準(zhǔn)(表2)。根據(jù)先證者及其家系成員臨床FH診斷繪制家系圖(圖2),符合顯性遺傳方式。外周血管超聲顯示:先證者雙側(cè)頸動脈輕度狹窄(直徑狹窄35%～45%),左頸IMT為0.21cm;右側(cè)頸總動脈可見小斑塊形成;左側(cè)股總動脈內(nèi)膜略增厚;雙側(cè)椎動脈、鎖骨下動脈、腹主動脈,雙側(cè)腎動脈、髂動脈、腘動脈均未見明顯內(nèi)膜增厚,管腔無明顯狹窄(圖3),其父母外周血管均未見異常變化。先證者的冠狀動脈血流儲備值為2.7(正常參考值為3.0),余心臟結(jié)果和功能大致正常。2.2受體內(nèi)化功能先證者及其父母LDL-R細(xì)胞表達(dá)量、4℃時受體結(jié)合功能都比正常人明顯下降,37℃時受體內(nèi)化功能未見較正常人異常;但父母的LDL-R功能水平介于先證者和正常人功能之間(表3、圖4)。2.3apo100缺陷癥患者的先證及其缺失基因①先證者ApoB100基因3500區(qū)域:經(jīng)核苷酸序列分析未發(fā)現(xiàn)ApoB1003500附近位點(diǎn)突變,提示,可排除由于患ApoB100缺陷癥導(dǎo)致臨床表現(xiàn)的可能性。②先證者LDL-R基因:對啟動子及18個外顯子片段的進(jìn)行核苷酸序列分析,發(fā)現(xiàn)第13外顯子第1864位堿基T取代了G,導(dǎo)致第601位氨基酸由脯氨酸取代了天冬氨酸,為D601Y純合錯義突變(圖5)。③其父母LDL-R基因:在第13外顯子發(fā)現(xiàn)同樣的D601Y雜合突變,提示父母分別將LDL-R突變的等位基因遺傳給先證者。3r基因d601y基因突變FH是一種最為常見且最為嚴(yán)重的常染色體顯性遺傳性疾病,其病理基礎(chǔ)是LDL-R基因突變引起細(xì)胞膜表面LDL-R缺陷或功能異常,進(jìn)而體內(nèi)LDL代謝紊亂,特征為血清TC尤其是LDL-C濃度明顯增高、多部位皮膚、肌腱黃色瘤、脂性角膜弓和早發(fā)AS。本研究收集了1例臨床診斷為FH純合子的家系,對該家系共43例成員進(jìn)行病史采集、血脂檢測,先證者及其父母進(jìn)行外周血管超聲、心臟超聲等臨床檢查。先證者肘、膝、踝關(guān)節(jié)多部位皮膚黃色瘤及肌腱黃色瘤逐漸增大,雙眼可見角膜弓,TC高達(dá)16mmol/L,血漿置換術(shù)后1年TC仍未見下降,符合臨床FH純合子診斷標(biāo)準(zhǔn)。超聲顯示先證者雙頸動脈IMT增加,右頸動脈已見小斑塊形成,提示AS進(jìn)程已經(jīng)開始;其父母雖TC水平中度升高,但未出現(xiàn)皮膚黃色瘤,外周血管超聲未見內(nèi)膜增厚。通過家系成員的血脂檢查發(fā)現(xiàn)多例TC增高的患者,該家系是顯性遺傳。,但在我國未見相關(guān)報道,提示該LDL-R基因D601Y突變有可能是我國FH人群一種新的突變類型。根據(jù)LDL-R代謝途徑,LDL-R基因突變分為合成缺陷、轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷、結(jié)合缺陷、內(nèi)移缺陷和再循環(huán)缺陷5種類型。該患者攜帶的D601Y突變發(fā)生在第13外顯子,位于LDL-R的表皮生長因子(EGF)前體同源域,此結(jié)構(gòu)為受體與配體在細(xì)胞質(zhì)的內(nèi)吞體中酸依賴性解離所必需,可能影響LDL-R的再次循環(huán)利用屬再循環(huán)缺陷。本文先證者父親和母親是FH雜合子,其LDL-R基因1個等位基因存在突變,因此僅產(chǎn)生半數(shù)具有正常結(jié)構(gòu)和功能的受體,血漿TC、LDL-C水平中度升高,LDL-R細(xì)胞表面表達(dá)量和結(jié)合LDL的功能較正常人低。純合子為2個等位基因同時存在功能性突變,因此不能表達(dá)LDL-R蛋白僅表達(dá)有功能缺陷的LDL-R蛋白,因此肝對LDL-C的代謝功能較雜合子更差,血漿LDL-C水平可達(dá)正常人的6倍以上,通常于兒童期發(fā)生AS甚至心腦血管意外。本文先證者為FH純合子,外周血管檢查結(jié)果證實(shí)AS嚴(yán)重,TC極度升高可達(dá)16mmol/L,LDL-R細(xì)胞表面表達(dá)量和結(jié)合LDL的功能分別僅為正常人的13.6%和21.1%,但內(nèi)化功能未見下降,與基因突變影響的結(jié)構(gòu)域有關(guān)。純合與雜合這種基因劑量效應(yīng)作用解釋了本研究中先證者及其父母間血脂水平、臨床表現(xiàn)、細(xì)胞LDL-R功能諸多方面存在差異。FH純合患者發(fā)病率僅為百萬分之一,但癥狀典型易于被發(fā)現(xiàn);而雜合患者發(fā)病率較高為1/500,我國大約有26000000例潛在患者,男性患者通常在40～50歲出現(xiàn)冠心病癥狀,而女性患者推遲10年。大量流行病學(xué)研究證實(shí):超過60%的男性FH雜合患者60歲之前可能患冠心病,女性則多于30%。相應(yīng)冠心病癥狀男性一般開始于40歲,女性在50歲左右。若按照目前的診斷標(biāo)準(zhǔn)僅能預(yù)測出大約1/4的FH病例;大多數(shù)患者直到中年才能得到確診,失去早期治療機(jī)會。他汀類、膽固醇吸收抑制劑和正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的ISIS301012等藥物能夠有效地降低FH患者的血清TC水平,防治AS進(jìn)展,并且越早治療患者受益越大,因此早期把FH雜合患者從人群中鑒別出來,將有助于預(yù)測其AS危險性,并早期進(jìn)行干預(yù),延緩并發(fā)癥發(fā)生。本研究對純合子患者的家系成員通過基因診斷的方法可以把FH雜合患者從人群中鑒別出來,并早期進(jìn)行生活方式和藥物治療,延緩AS的發(fā)生,預(yù)防早發(fā)冠心病。綜上所述,本文對1例臨床確診FH純