飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的測定 高效液相色譜法 編制說明

1根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)關(guān)于下達(dá)2021年第二素酸乙酯的測定高效液相色譜法》，項(xiàng)目主持單位為貴州省獸藥飼料檢測所。β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯又叫阿樸胡蘿卜素酸乙酯、天然橙7號(hào)或阿樸酯標(biāo)組織中沉積率較高，著色效果顯著高于β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛及萬壽菊提取物[2-5]。部分文獻(xiàn)表明，家禽日糧中添加一定量的β家禽機(jī)體免疫力，促進(jìn)雛禽發(fā)育[6-9]。β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯廣泛存在于自然界中，主要是青草、紫花苜蓿、-8′-胡蘿卜素酸乙酯純品通常為紅紫色的結(jié)晶，分子式為C32H44O2，分子量比例會(huì)不同，自然界全反式比例為70%-90%），在正圖1β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯結(jié)構(gòu)式2提高產(chǎn)品競爭力。我國《飼料添加劑品種目錄（2013）》（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)：β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯使用廣泛、添加混亂、檢測標(biāo)準(zhǔn)缺失、養(yǎng)殖者認(rèn)知匱乏、不利監(jiān)管等問題。一是禽飼料中使用廣泛。2019年至無飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量檢測推薦性國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，各級準(zhǔn)確測定飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量的標(biāo)準(zhǔn)方法，填補(bǔ)技術(shù)空白，有發(fā)布有農(nóng)業(yè)農(nóng)村部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《飼料中斑蝥黃的測定高效液相色譜法》（NY/T劑）的國家推薦標(biāo)準(zhǔn)[18]，尚無飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量檢測的強(qiáng)制含量。楊梅等[21]采用固相萃取技術(shù)處理樣品，通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對禽蛋中的斑蝥黃和進(jìn)行分離和檢測。章厲劼等[22]參照飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛檢測方法，使用甲醇、正己烷和乙酸乙酯提取飼料中的3高效液相色譜法（HPLC）操作簡便、檢測準(zhǔn)確、在實(shí)際檢測中的定性和定量要求。本研究擬制定《飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的測定高效液相色譜法》，采用水分散試樣，再用無水乙醇和二氯甲烷提取飼料中的β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯，用固相萃取小柱對目標(biāo)物進(jìn)行凈化和富集，最后采用反相HPLC法進(jìn)行分析，用外標(biāo)法定量試樣中順、反式β-阿樸-8′-標(biāo)準(zhǔn)起草小組，對標(biāo)準(zhǔn)起草工作進(jìn)行分工，明2021年9月，起草小組系統(tǒng)匯總分析了以前工作過程中廣泛查閱和搜集的國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)資料，通過主要生產(chǎn)廠家的解β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯開展了標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)要求中規(guī)定項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)研究工作，制定了飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量測定方法。對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，撰寫標(biāo)準(zhǔn)文本意見，共收到20名專家，99條意見。起草小組根據(jù)4術(shù)研究院、遼寧省農(nóng)產(chǎn)品及獸藥飼料產(chǎn)品檢20001.4－2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求編寫。在標(biāo)2.2方法試驗(yàn)條件研究β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯（純度≥99.8%）購自瑞士CaroteNature公司。mL）購自美國Agilent公司。分析純無水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷和光學(xué)純高效液相色譜儀配備二極管陣列檢測器（Ultimate3000，美國Thermo美國ThermoScientific公司）、超聲波清洗器（KQ-250D，昆山市超聲儀器有限公司）、超純水儀（Millipore，德國EMDMillipore公司）、萬分之一天平（AB104-S，瑞士MettlerToledo公司）、十萬分之一天平（XSR205DU，瑞士高效液相色譜儀在檢測β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯時(shí)，需分別檢測順、反式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的峰面積進(jìn)行計(jì)算，參考?xì)W洲飼料添加劑生產(chǎn)商協(xié)會(huì)5（FEFANA）標(biāo)準(zhǔn)《FEFANATaskForceAnalyticaβ-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯色譜峰面積為反式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯峰面2.2.3色譜條件的選擇和優(yōu)化離度符合要求，峰型較好，但后者成本較高，毒性相對較大，因此選用乙腈-甲流動(dòng)相比例出峰時(shí)間（min）峰面積（mAU*min）峰高（mAU）分離度不對稱度理論塔板數(shù)來源（95：5）35.29372.871799.542.07飼料中斑蝥黃的測定高效液相色譜法（NY/T2896-2022）超高效液相色譜（90-10）未出峰/////法測定飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量方法的研究（95：5）（20：80）16.79313.33767.594383.5037218.74256.830.88飼料中角黃素的高效液相色譜法優(yōu)化后方法67分別選用WatersSymmetry?C18色譜柱（250mm×4.6mm，粒徑5μm）、89的流速，通過檢測禽配合飼料陽性添加樣品（80mg/kg）色譜圖進(jìn)行順反β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯分離效果相對較差，因此確定本方法色譜柱柱溫），2.2.4樣品提取條件的選擇和優(yōu)化因此，試驗(yàn)以10%β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料添加樣品名稱吸光度質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）平均值（%）RSD值（%）添加劑10.10020.508添加劑10.10160.509添加劑10.09910.5020.82添加劑10.10040.506添加劑10.10180.5069.94β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯與斑蝥黃理化性質(zhì)相似，試驗(yàn)選取標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)中與《超高效液相色譜法測定飼料中斑蝥黃和β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量方法β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯與斑蝥黃等常用著色劑在禽飼料中含量總計(jì)不能超過表3不同提取方法提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況方法來源主要提取步驟回收率（%）結(jié)果分析10%β-阿樸GB/T21516-2008飼料中斑蝥黃的測定高效液相色譜法NY/T2896-2022土雞蛋中添加劑斑蝥黃的色譜質(zhì)譜連用檢（參考文獻(xiàn)）超高效液相色譜法測定飼料中斑蝥黃和β-卜素酸乙酯含量方法的研究（參考文獻(xiàn)）飼料中角黃素的高效液相色譜法測定（參考文獻(xiàn)）準(zhǔn)確稱取陽性添加樣品5g于250mL棕色容量瓶中，加入10mL預(yù)熱至60℃的水，水浴超聲處理20min。冷卻后，加入100mL無水乙醇和100mL三氯甲烷，搖勻后常溫水浴超聲處理5min，用三氯甲烷定容。準(zhǔn)確稱取陽性添加樣品5g于100mL棕色容量水浴中超聲處理5min。冷卻后，加入50mL無水乙醇和30mL二氯甲烷，搖勻后常溫水浴超聲處理20min，用二氯甲烷定容。準(zhǔn)確稱取陽性添加樣品5g于100mL棕色容量瓶中，加入50mL乙腈，超聲處理30min。冷卻后用乙腈定容。準(zhǔn)確稱取陽性添加樣品2g于50mL離心管中，分別加入水8mL，飽和氯化鈉溶液4mL，0.05%乙酸溶液4ml，搖勻，加入提取劑（甲醇、乙酸乙酯、正己烷，體積比為1:1:1）10mL，渦旋2min，然后與5000r/min離心5分鐘，用滴管吸取上層萃取液于另一個(gè)離心管，再加入提取劑10mL進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，合并萃取液后，加入2mL無水乙醇，于40℃下氮?dú)獯蹈?。用甲基叔丁基?乙腈(1+9)溶液5.0mL溶解殘余物。準(zhǔn)確稱取陽性添加樣品5g于100mL具塞離心管中，加入30mL乙腈和20mL乙腈飽和的正移入分液漏斗中，收集乙腈層，重復(fù)1次，合并萃取液后40℃氮吹至2mL，甲醇定容至10mL。88.09.369.78提取試劑比例不適配合飼料，且試劑用量過大較好木質(zhì)素磺酸鹽進(jìn)行包被，純乙取。繁瑣較差，且操瑣用二氯甲烷作為主要提取試劑，但更多文獻(xiàn)表明：β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯易溶于三氯甲烷。使用三氯甲烷與二氯甲烷進(jìn)行對比，分別提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料陽性添加樣品（80mg/k），取試劑檢測結(jié)果接近，都能夠有效提取飼料中的β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯，但表4二氯甲烷與三氯甲烷提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況提取試劑回收率（%）平均回收率（%）二氯甲烷三氯甲烷98.7（2）提取試劑比例優(yōu)化參照《飼料中斑蝥黃的測定高效液相色譜法》（NY/T2896-2022）中提試驗(yàn)調(diào)整不同提取試劑的比例，分別按步驟檢測β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料），表5不同比例提取試劑提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況提取試劑比例回收率（%）平均回收率（%）水-乙醇-二氯甲烷（15:50:35）乙醇-二氯甲烷（50:50）6.916.676.886.696.906.81水-二氯甲烷（15:85）提取溶液分層，無法定容/二氯甲烷（100）7.187.047.167.02結(jié)果表明，β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯表面往往進(jìn)行包被，二氯甲烷直接提法，分別添加不同溫度的水并設(shè)置不同超聲溫度，對β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料陽性添加樣品（80mg/kg）進(jìn)行提取試驗(yàn)，檢測結(jié)果表7不同超聲溫度提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況提取溫度(℃)回收率（%）平均回收率（%）4095.795.8表8不同超聲時(shí)間提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況超聲時(shí)間（min）回收率（%）平均回收率（%）082.286.292.686.0594.595.296.395.697.895.998.692.793.798.297.72096.6通過回收率比較不同稱樣質(zhì)量對檢測結(jié)果的影響，檢測結(jié)果見表9，結(jié)果表明，表9不同稱樣質(zhì)量提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況稱樣質(zhì)量（g）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）2.597.099.298.852.420.722.233.021.923.324.220.6樣品粉碎細(xì)度的選擇表10不同粉碎細(xì)度提取β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的情況粉碎細(xì)度（mm）回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）0.4252.40.25090.9104.097.8104.2103.05.7部分文獻(xiàn)表明，β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯對光和氧不穩(wěn)定，為檢測提取條件下光照和氧對飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯是否存在影響，試驗(yàn)配制20無明顯影響，不影響飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的提取結(jié)果，因此無需針 表11β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯在光照和氧條件下穩(wěn)定性的情況標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/kg）檢測時(shí)間（h）峰面積（mAU*min）RSD（%）20088.290220188.859220288.707720388.767520488.827620588.655920688.68300.2320788.686320888.894820988.82562088.83342089.13822089.04702.2.6凈化方法的選擇和優(yōu)化氣吹干，乙腈復(fù)溶后加水稀釋，過固相萃取柱，β-阿樸-8′-胡在固相萃取柱上，經(jīng)50%乙腈水溶液淋洗去除雜質(zhì)，再用乙腈洗脫β-阿樸-8′-胡表12不同填料固相萃取柱對回收率的影響凈化柱種類回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）親水親脂平衡固相萃取柱2.4C18固相萃取柱87.094.493.998.592.692.34.5中性氧化鋁固相萃取柱46.461.643.656.647.051.1取柱進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見表13。結(jié)果表明，不同規(guī)格的凈化柱對回收率無較大影凈化柱種類回收率（%）平均回收率（%）RSD（%）BondElutPlexa60mg/3mL2.4BondElutPlexa200mg/6mL2.6黃凈化方法，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙腈對β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯同樣具有較好的洗脫效表14不同洗脫體積對回收率的影響洗脫體積回收率（%）平均回收率（%）乙腈（3mL）89.287.393.494.498.692.6乙腈（5mL）乙腈（10mL）表15不同氮吹溫度對回收率的影響氮吹溫度(℃)回收率（%）平均回收率（%）40難以吹干/92.389.086.293.994.391.1復(fù)溶液種類回收率（%）平均回收率（%）腈（1:9）液相色譜法》（NY/T2896－2022）一化柱凈化，回收率測定結(jié)果見表17，結(jié)果表明，所選的凈化柱規(guī)格能夠滿足檢陽性樣品含量（mg/kg）回收率（%）平均回收率（%）添加劑預(yù)混合飼料試樣前處理優(yōu)化保凈化柱不過載，試驗(yàn)對比添加劑預(yù)混合飼料陽性添加樣品（5mg/kg）凈化前標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制將β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用乙腈稀釋，配制成濃度為0.05標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制將β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液依次注入液相色譜儀，以β-素酸乙酯和順式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯峰面積之和為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作配合飼料、濃縮飼料和精料補(bǔ)充料加入15mL水，混勻，常溫超聲5min。加入50mL無水乙醇和30mL二氯甲烷，取20mL上層提取液置于50mL離心管中，于8000r/min離心5min，準(zhǔn)確吸取上清液5mL（V1）到10mL離心管中，于50℃氮?dú)獯蹈?，?mL乙腈復(fù)溶，再加添加劑預(yù)混合飼料和混合型飼料添加劑平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣2.5g（精確至0.1g），置于100mL棕色容量瓶中，加入15mL水，常溫超聲5min。加入50mL無水乙醇和30mL二氯甲烷，混），取部分提取液至離心管中，于8000r/min離心5min，準(zhǔn)確吸取上清液5mL高效液相色譜參考條件b）柱溫：30℃;（1）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液的測定以保留時(shí)間定性，試樣溶液中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯保留時(shí)間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)系列中濃度相當(dāng)?shù)摩?阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的保留時(shí)間一致，其相對以β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱注：色譜峰面積為反式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯峰面積與1.4倍順式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯峰面積之和，1.4為順式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯對反式β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的校正因子。w=……（1）ρ——由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的質(zhì)量）；）；V1——用于凈化的提取液體積，單位為毫）；）；）；2.3方法主要技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證20.0μg/mL和40.0μg/mL標(biāo)阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/mL）（反式）峰面積（mAU*min）（順式）峰面積（mAU*min）順反式總峰面積（mAU*min）0.050.218700.21870.410200.41020.52.050302.050314.062604.0626520.6487020.64872082.3456082.345640162.37330162.3733開能力，試驗(yàn)稱取0.5gβ-阿樸-8′-胡蘿），提取試劑—水-乙醇-二氯甲烷（15:50:35）超聲提取，稀釋后上機(jī)檢測，檢測結(jié)表610%β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料添加劑檢測情況樣品名稱β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯含量（%）平均回收率（%）10%β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料添加劑-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料添加劑的木質(zhì)素磺酸鹽包被，有效提取飼料中的β-阿補(bǔ)充料檢出限為0.15mg/kg，定量限為0.5mg/kg；添加劑預(yù)混合飼料檢出限為為了驗(yàn)證該方法能夠不受其他物質(zhì)影響，準(zhǔn)確的測定出飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的含量。在空白樣品中分別添加β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯、斑蝥序號(hào)峰面積（反式mAU*min）平均峰面積（反式）（mAU*min）RSD（%）128.4965228.4190328.4257429.479928.7528.9531628.4965法進(jìn)行前處理并上機(jī)檢測，查看β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯保留時(shí)間是否存在干圖27配合飼料（蛋雞）空白樣品色譜圖圖28配合飼料（小雞）空白樣品色譜圖圖29配合飼料（肉雞）空白樣品色譜圖圖30配合飼料（蛋鴨）空白樣品色譜圖圖31配合飼料（肉鴨）空白樣品色譜圖圖32復(fù)合預(yù)混合飼料（蛋雞）空白樣品色譜圖圖33復(fù)合預(yù)混合飼料（肉雞）空白樣品色譜圖圖34配合飼料（豬）空白樣品色譜圖圖35精料補(bǔ)充料（牛、羊）空白樣品色譜圖圖36濃縮飼料（豬）空白樣品色譜圖圖34配合飼料（魚）空白樣品色譜圖圖38濃縮飼料（蛋雞）空白樣品色譜圖圖39濃縮飼料（肉雞）空白樣品色譜圖圖40維生素預(yù)混合飼料空白樣品色譜圖平，確定β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯在配合飼料、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料中的添加使用10%β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯飼料添加劑作圖41配合飼料（蛋雞）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖42配合飼料（小雞）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖43配合飼料（肉雞）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖44配合飼料（蛋鴨）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖45配合飼料（肉鴨）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖46復(fù)合預(yù)混合飼料（蛋雞）陽性添加（添加濃度5mg/kg）色譜圖圖47復(fù)合預(yù)混合飼料（肉雞）陽性添加（添加濃度5mg/kg）色譜圖圖48配合飼料（豬）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖49精料補(bǔ)充料（牛、羊）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖50濃縮飼料（豬）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖51配合飼料（魚）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖52濃縮飼料（蛋雞）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖53濃縮飼料（肉雞）陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖圖54維生素預(yù)混合飼料陽性添加（添加濃度0.5mg/kg）色譜圖添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果上機(jī)液濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，試驗(yàn)結(jié)果見表20-33。在0.5-8000mg/kg表20配合飼料（蛋雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表21配合飼料（小雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表22配合飼料（肉雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表23配合飼料（蛋鴨）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表24配合飼料（肉鴨）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表25復(fù)合預(yù)混合飼料（蛋雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表26復(fù)合預(yù)混合飼料（肉雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表27配合飼料（豬）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表28精料補(bǔ)充料（牛、羊）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表29濃縮飼料（豬）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表30配合飼料（魚）添加回收試驗(yàn)結(jié)果（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系數(shù)（n=5，%）批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表31濃縮飼料（蛋雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系數(shù)（n=5，%）批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表32濃縮飼料（肉雞）添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表33維生素預(yù)混合飼料添加回收試驗(yàn)結(jié)果添加濃度（mg/kg）回收率（%）批內(nèi)平均回收率（%）批內(nèi)變異系批間平均回收率（%）批間變異系數(shù)（n=3，%）5表34方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果添加含量（mg/kg）儀器型號(hào)檢測結(jié)果（mg/kg）算術(shù)平均值（mg/kg）允許偏差（mg/kg）實(shí)際偏差（mg/kg）0.50.4660.5044.710.485≤0.0480.01954.9840.34.845≤0.4840.1354037.882.439.05≤3.9086.784.55≤8.462.152.4標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液有效期考察將β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液定量移取分裝一份定量分裝的儲(chǔ)備溶液用乙腈稀釋成40μg/mL，再用HPLC測定色譜峰純度和峰面積，以考察儲(chǔ)備溶液在－18℃保存條件下的穩(wěn)定性。連續(xù)測定1個(gè)月，檢測方式7d檢測時(shí)間21d28d35d平均值RSD（n=7,%）吸光度0.4970.4960.4960.4960.4960.4970.4960.496mAU*min）169.852170.705169.339171.093169.522171.063170.8730.4相對峰面積（反式，%）99.92099.92099.92099.92099.92099.92099.93099.90.0峰面積（順式）（mAU*min）0.1290.1300.1360.1380.1360.1290.1390.1343.3相對峰面積（順式，%）0.0800.0800.0800.0800.0800.0800.0700.0794.8編號(hào)樣品名稱來源結(jié)果（mg/kg）1產(chǎn)蛋雞高峰期配合飼料湖南未檢出2小雞配合飼料貴州未檢出3肉用仔雞中期配合飼料安徽6.794肉中雞配合飼料II型貴州2.965快大肉大雞配合飼料貴州4.246肉大雞配合飼料云南6.707128肥雞配合飼料廣西13.48蛋鴨配合飼料安徽7.379產(chǎn)蛋鴨配合飼料安徽未檢出10肉大鴨配合飼料I型貴陽6.5611肥鴨配合飼料安徽未檢出12蛋鵪鶉產(chǎn)蛋期配合飼料貴州未檢出13蛋鴨自配料河北未檢出14肉雞自配料貴州未檢出15蛋雞產(chǎn)蛋期自配料貴州4.57165%蛋雞產(chǎn)蛋期復(fù)合預(yù)混合飼料湖北未檢出175%蛋雞產(chǎn)蛋期復(fù)合預(yù)混合飼料河南8618蛋雞產(chǎn)蛋后期復(fù)合預(yù)混料河北3.85191%肉用仔雞中期預(yù)混料廣西未檢出20生長育肥豬配合飼料貴州未檢出21牛、羊精料補(bǔ)充飼料貴州未檢出22乳豬濃縮飼料貴州未檢出23鱘魚配合飼料廣東未檢出24蛋雞濃縮飼料貴州未檢出25肉雞濃縮飼料貴州未檢出26維生素預(yù)混合飼料重慶未檢出27龍蝦配合飼料湖北未檢出28黃顙魚膨化配合飼料四川未檢出度范圍時(shí)，批內(nèi)平均回收率為80.4%-間平均回收率為82.2%-108.9%各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足要求，方法重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確，果五、采標(biāo)情況，以及是否合規(guī)引用或采用國際國外標(biāo)準(zhǔn)七、重大分歧意見的處理經(jīng)過和依據(jù)無八、涉及專利的有關(guān)說明飼料中β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯的含量進(jìn)行有效檢測，幫助飼料生產(chǎn)企業(yè)控制品,2013(06):440-442.[2]朱基美.β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯及其研究進(jìn)展[J].廣東飼料,2012,21(增刊1):84-86.[3]王海威,王麗輝,粟劍,等.加麗素紅、加麗素黃對黃羽肉雞生長性能及胴體著色的影響[J].飼料博覽,2014(01):1-3.[4]Casta?edaMP,HirschlerEM,SamsAR.Skinpigmentationevaluationinbroilersfednaturalandsyntheticpigments.Poultryscience.2005,84(1):PP143-